鉴定活性OGA所需结构域
确定OGA中负责去糖基化活性的最小结构域。
构建催化域、缺失HAT结构域及GS连接子替换的OGA变体，与GFP-Nup62共转染，免疫沉淀后检测O-GlcNAc水平。
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通过纳米抗体融合的分裂型O-GlcNAc糖苷酶在活细胞中实现靶蛋白去糖基化
Target protein deglycosylation in living cells by a nanobody-fused split O-GlcNAcase.
实验完整度
高包含体外细胞模型（HEK 293T）、多种纳米抗体-标签对、定量蛋白质组学（TMT-MS）和功能验证（蛋白稳定性、转录活性）。
主要模型
HEK 293T细胞 GFP-Nup62、GFP-Sp1、GFP-JunB、GFP-c-Jun、c-Fos-Ubc等靶蛋白
重点核对
筛选分裂OGA各片段组合（N1-N3，C1-C4） D174N催化失活突变作为阴性对照 使用四种纳米抗体（nGFP、nEPEA、nBC2、nUbc） 定量蛋白质组学评估全局O-GlcNAc影响 CHX处理测定蛋白稳定性
摘要
O-GlcNAc是一种必需且动态的翻译后修饰，存在于数千种核质蛋白上。研究单个靶蛋白上O-GlcNAc的作用至关重要，但在细胞中实施具有挑战性。在此，我们开发了一种纳米抗体融合的分裂型O-GlcNAc糖苷酶（OGA），作为O-GlcNAc擦除器，用于在细胞中选择性去除靶蛋白的糖基化。经过系统的细胞优化，我们鉴定了一种分裂型OGA，其固有的糖苷酶活性降低，当由纳米抗体引导时，可选择性地去除目标蛋白上的O-GlcNAc。我们使用四种针对五个靶蛋白的纳米抗体证明了纳米抗体融合分裂型OGA的通用性，并利用该系统研究了转录因子c-Jun和c-Fos上O-GlcNAc的功能。纳米抗体引导的O-GlcNAc擦除器提供了一种新策略，通过在细胞中直接从单个蛋白上去除O-GlcNAc，对O-GlcNAc进行功能评估和工程化。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何实现靶蛋白特异性的O-GlcNAc去除，以研究其在细胞内的功能？
- 核心机制
- 纳米抗体引导的分裂型OGA通过降低固有活性并利用纳米抗体靶向，实现靶蛋白特异性的去糖基化。
- 主要证据
- 在HEK 293T细胞中，nGFP-splitOGA有效去除GFP-Nup62等靶蛋白的O-GlcNAc，且全局O-GlcNAc水平变化极小；定量蛋白质组学显示其选择性。
- 研究意义
- 提供了直接在细胞内研究单个蛋白O-GlcNAc功能的策略，并可与纳米抗体-OGT结合实现双向调控。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
优化分裂OGA片段
获得固有活性低但可通过纳米抗体恢复的分裂OGA片段组合。
生成N1-N3和C1-C4片段，配对筛选活性，并测试nGFP融合对活性的影响。
验证靶蛋白选择性去糖基化
评估nGFP-splitOGA对不同靶蛋白的去糖基化效率和特异性。
检测nGFP-splitOGA对GFP-Nup62、GFP-Sp1、GFP-JunB的去糖基化，并进行定量蛋白质组学分析全局O-GlcNAc变化。
多种纳米抗体-标签对的应用
证明该系统可适配不同纳米抗体-表位标签对，具有通用性。
测试nEPEA、nBC2、nUbc-splitOGA对Nup62-Ubc-EPEA和c-Fos-Ubc的去糖基化。
功能研究：c-Jun稳定性
验证O-GlcNAc对c-Jun蛋白稳定性的直接作用。
使用nGFP-splitOGA特异性去除GFP-c-Jun的O-GlcNAc，结合CHX处理监测蛋白降解。
功能研究：c-Fos转录活性
评估O-GlcNAc对c-Fos驱动的AP-1转录活性的影响。
使用nUbc-splitOGA去除c-Fos-Ubc的O-GlcNAc，并与OGT抑制剂OSMI-4b处理对比，检测AP-1荧光素酶活性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证功能变化
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | 11995073 |
| TransIT-PRO转染试剂 | Mirus Bio | MIR 5740 | |
| 细胞裂解 | M-PER裂解缓冲液 | Thermo Scientific | 78501 |
| cOmplete蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | 11873580001 | |
| Thiamet-G | Sigma-Aldrich | SML0244 | |
| 免疫沉淀 | C-tag亲和基质 | Thermo Scientific | 191307005 |
| Anti-FLAG M2磁珠 | Sigma-Aldrich | M8823 | |
| 抗HA磁珠 | Pierce | 88836 | |
| 抗c-Myc磁珠 | Pierce | 88842 | |
| His标签磁珠 | Invitrogen | 10103D | |
| Biotin-IP | 链霉亲和素磁珠 | -- | -- |
| 蛋白质定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | G-Biosciences | 786 |
| 免疫印迹 | anti-O-GlcNAc (RL2)抗体 | Abcam | ab2739 |
| 抗Flag抗体 | Sigma-Aldrich | F3165 | |
| 抗OGA抗体 | Sigma-Aldrich | HPA036141 | |
| 抗DYKDDDDK标签抗体 | Cell Signaling Technology | 14793 | |
| 抗myc抗体 | Cell Signaling Technology | 2276 | |
| 抗HA抗体 | Cell Signaling Technology | 3724 | |
| 抗GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 5174 | |
| 抗OGT抗体 | Cell Signaling Technology | 24083 | |
| 抗His标签抗体 | Cell Signaling Technology | 12698 | |
| 抗CREB抗体 | Cell Signaling Technology | 9197 | |
| 抗c-Jun抗体 | Cell Signaling Technology | 60A8 | |
| 抗c-Fos抗体 | Cell Signaling Technology | 2250 | |
| 抗Nup62抗体 | BD Biosciences | 610497 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 | |
| 化学酶标记 | 二硫苏糖醇 | Thermo Scientific | 20290 |
| UDP-GalNAz | -- | -- | |
| 半乳糖基转移酶Y289L | -- | -- | |
| 质量位移实验 | DBCO-PEG-5kDa | Click Chemistry Tools | A118 |
| CuAAC | THPTA | Sigma-Aldrich | 762342 |
| Biotin-PEG4-炔基 | Click Chemistry Tools | TA105 | |
| 蛋白质组学 | 胰蛋白酶 | Promega | V5111 |
| TMT10/16plex试剂 | Thermo Scientific | 90406 / A44520 | |
| 免疫荧光 | NucBlue固定细胞染色 | Invitrogen | R37606 |
| 抗淬灭封片剂 | Life Technologies | P36961 | |
| 荧光素酶报告 | 荧光素酶检测系统 | Promega | E1500 |
| 药物处理 | OSMI-4b | homemade | -- |
| Ac45SGlcNAc | homemade | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与转染 | HEK 293T细胞、DMEM培养基、10% FBS、TransIT-PRO转染试剂 阅读提示：Methods: Cell culture and transfection |
| 分裂OGA构建 | N2片段、C3片段、nGFP融合、D174N失活突变 阅读提示：Results: Optimizing a selective nanobody-directed split OGA; Fig. 2 |
| 去糖基化检测 | 靶蛋白（GFP-Nup62等）、免疫沉淀（anti-EPEA或anti-Flag）、RL2抗体 阅读提示：Methods: Immunoprecipitation and Immunoblot assays |
| 定量蛋白质组学 | 化学酶标记、TMT标记、LC-MS/MS 阅读提示：Methods: Quantitative chemical proteomics; Extended Data Fig. 7 |
| 功能分析 | CHX浓度、AP-1荧光素酶报告、OSMI-4b浓度 阅读提示：Methods: Cycloheximide treatment; Luciferase reporter assay |