抗体生成和人源化
获得能结合人鼠CTLA-4的抗体
用hCTLA-4和mCTLA-4 ECD免疫SD大鼠，电融合产生杂交瘤，筛选结合人鼠猴CTLA-4的克隆，并通过CDR移植进行人源化，得到mAb146（人IgG1）。
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一种通过结合N-糖基化表位与人鼠细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4交叉反应的功能性抗体
A functional antibody cross-reactive to both human and murine cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4 via binding to an N-glycosylation epitope.
实验完整度
高包含抗体生成、结合动力学、配体竞争、ADCC/ADCP、体内疗效及表位作图等多个实验层级，且有功能验证和机制验证。
主要模型
人CTLA-4表达细胞（293F） 小鼠CT26同基因肿瘤模型 CD80/CD86表达CHO细胞
重点核对
mAb146与人CTLA-4结合的EC50为0.03 nM，与鼠CTLA-4结合的EC50为0.19 nM mAb146在SPR中与人CTLA-4的KD为0.477 nM，与鼠CTLA-4的KD为1.39 nM mAb146在CT26模型中以1、3、10 mg/kg剂量给药，10 mg/kg组完全缓解 mAb146的结合依赖于N110糖基化，PNGase F处理后结合显著降低 mAb146与ipilimumab在ELISA中竞争CD80/CD86的IC50相近，但在FACS中阻断活性更强
摘要
细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4，CD152）是T细胞上的一种受体，可抑制细胞的功能。使用抗体阻断CTLA-4已被证明对治疗癌症患者有效。目前批准用于临床的抗CTLA-4抗体可以结合人CTLA-4，但不会与鼠CTLA-4交叉反应。在此，我们报告了一种功能性人源化抗体mAb146的生成和表征，该抗体针对人和小鼠CTLA-4。使用哺乳动物细胞表达盒对CTLA-4进行丙氨酸扫描，确定了这种新型抗体的独特表位。除了与配体CD80和CD86相互作用的氨基酸残基外，N110上的N-糖基化位点（在人类、猴和小鼠的CTLA-4中保守）被确定为特异性表位，可能有助于该抗体的跨物种结合和功能。这一发现也可能有助于理解CTLA-4的糖基化及其相关生物学功能。除了促进抗CTLA-4抗体的临床前开发外，mAb146可能作为治疗剂有用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否开发一种与人鼠CTLA-4交叉反应的功能性抗体，并确定其表位和抗肿瘤机制？
- 核心机制
- mAb146通过结合CTLA-4的MYPPPY基序和N110糖基化表位，阻断CD80/CD86相互作用，并通过Fc效应功能介导ADCC/ADCP，可能通过消耗Tregs产生抗肿瘤活性。
- 主要证据
- 通过ELISA和SPR证明交叉反应性；通过丙氨酸扫描和PNGase F处理证明N110糖基化表位；在CT26同基因模型中显示剂量依赖性肿瘤抑制和完全缓解；ADCC/ADCP实验证明效应功能。
- 研究意义
- mAb146可促进抗CTLA-4抗体的临床前开发，并可能作为治疗剂，同时为CTLA-4糖基化功能提供见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
结合特性和动力学分析
评估mAb146与不同物种CTLA-4的结合亲和力
用ELISA检测mAb146和ipilimumab与人、猴、鼠CTLA-4的结合，用SPR测定动力学常数。
配体竞争实验
评估mAb146阻断CTLA-4与CD80/CD86结合的能力
通过ELISA和FACS检测mAb146和ipilimumab阻断人/鼠CD80/CD86与CTLA-4结合的能力。
ADCC和ADCP效应评估
评估mAb146的Fc效应功能
以人CTLA-4表达293F细胞为靶细胞，进行ADCC和ADCP实验，与ipilimumab比较。
体内疗效研究
评估mAb146在CT26同基因模型中的抗肿瘤疗效
Balb/C小鼠皮下接种CT26细胞，当肿瘤体积达60-80 mm3时分组治疗，测量肿瘤体积。
表位定位
确定mAb146在hCTLA-4上的结合表位
通过丙氨酸扫描和突变体（N78Q、N110Q、N78Q/N110Q）检测mAb146结合变化，并使用PNGase F去糖基化验证N-糖基化表位。
抗体建模和对接
了解mAb146与CTLA-4的相互作用结构基础
使用MODELER同源建模构建mAb146结构，ZDOCK进行对接，并进行20 ns分子动力学模拟。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| ELISA | 人CTLA-4-6xHis单体 | -- | -- |
| 食蟹猴CTLA-4-6xHis单体 | -- | -- | |
| 小鼠CTLA-4-6xHis单体 | -- | -- | |
| HRP标记的山羊抗人IgG抗体 | Bethyl Laboratories | A80-119P | |
| TMB底物 | -- | -- | |
| 配体竞争 | 人CD80-His标签 | Sino Biological | 10698-H08H |
| 人CD86-His标签 | Sino Biological | 10699-H08H | |
| 小鼠CD80-His标签 | Sino Biological | 50446-M08H | |
| 小鼠CD86-His标签 | Sino Biological | 50068-M08H | |
| 生物素化的抗His标签抗体 | Genscript | A00613 | |
| HRP标记的链霉亲和素 | Invitrogen | -- | |
| 链霉亲和素PE | eBioscience | -- | |
| ADCC | DELFIA® EuTDA细胞毒性试剂 | PerkinElmer | AD0116 |
| ADCP | 人单核细胞富集试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-050-201 |
| 重组人M-CSF | R&D | 216-MC | |
| APC标记的抗人CD14抗体 | eBioscience | 17-0149-42 | |
| 动物实验 | 抗小鼠CTLA-4抗体9H10 | BioXCell | BE0131 |
| 表位定位 | PNGase F | New England Biolabs | -- |
| Ni-NTA柱 | GE Healthcare | -- | |
| Protein A柱 | GE Healthcare | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 抗体结合实验 | 包被抗原浓度、抗体浓度梯度、孵育时间和温度 阅读提示：Methods: ELISA assay |
| 配体竞争实验 | 配体浓度（hCD80/hCD86 0.25 μg/mL，mCD80 0.5 μg/mL，mCD86 5 μg/mL）、抗体浓度梯度、孵育条件 阅读提示：Methods: Competition with ligands |
| ADCC实验 | 效应细胞（PBMC）与靶细胞比例、孵育时间（4小时）、靶细胞数量 阅读提示：Methods: ADCC and ADCP assays |
| ADCP实验 | 巨噬细胞与靶细胞比例（1:1）、孵育时间（3小时）、抗体浓度 阅读提示：Methods: ADCC and ADCP assays |
| 体内疗效实验 | 小鼠品系和年龄、接种细胞数（1×10^5）、肿瘤体积分组标准（60-80 mm3）、给药剂量和时间、样本量（n=6-8） 阅读提示：Animal model section and Figure 4 legend |