构建人源化ALD小鼠模型
建立携带患者来源ABCD1 c.1534G>A突变的人源化小鼠模型，以模拟ALD的遗传缺陷和生化表型。
通过TILD-CRISPR方法将含有c.1534G>A突变的人ABCD1 cDNA（2778 bp）插入小鼠Abcd1基因5' UTR，通过显微注射Cas9 mRNA和RG2-sgRNA及供体DNA到C57BL/6N受精卵，获得F0代后与野生型交配获得F1代，经PCR和Sanger测序确认正确整合。
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体内腺嘌呤碱基编辑在人源化小鼠模型中挽救肾上腺脑白质营养不良症
In vivo adenine base editing rescues adrenoleukodystrophy in a humanized mouse model
实验完整度
高包含人源化小鼠模型构建、体外患者成纤维细胞碱基编辑与先导编辑验证、脱靶检测（Cas-OFFinder、Digenome-seq、RNA-seq）以及体内AAV递送后的基因编辑效率和代谢疗效评估，多层级验证且包含功能验证。
主要模型
人源化ALD小鼠模型（hALD，C57BL/6N背景，插入人ABCD1 c.1534G>A cDNA） 患者来源成纤维细胞（ABCD1 c.1534G>A） HEK293T细胞和293T-target细胞系
重点核对
hALD小鼠模型通过TILD-CRISPR将含人ABCD1 c.1534G>A突变的cDNA插入小鼠Abcd1 5' UTR，并验证了基因型、表达和VLCFA积累 体外碱基编辑使用NG-ABE8e(V106W)和gx19 sgRNA，在患者成纤维细胞中A-to-G校正效率为7.44% 体内通过尾静脉注射AAV-PHP.B递送split-NG-ABE8e(V106W)和gx19 sgRNA，高剂量组（6.4×10^12 vg/载体）在大脑区域E的基因组DNA校正效率达5.5%，在脑区域C的cDNA达10% 脱靶分析：在17个预测脱靶位点中，OT1和OFF02位点检测到低水平编辑（OT1在患者成纤维细胞中约1%，OFF02在293T-target细胞中为12.82%），且转录组A-to-I编辑无显著变化 血浆VLCFA分析显示高剂量AAV组C26:0/C22:0比值显著降低49%，但C26:0水平无显著变化
摘要
X连锁肾上腺脑白质营养不良症（ALD）是一种由ABCD1基因（编码过氧化物酶体ABC转运蛋白）突变引起的遗传性神经代谢疾病，主要影响脑、脊髓、肾上腺和睾丸。在ALD患者中，极长链脂肪酸（VLCFAs）无法进入过氧化物酶体并进行后续的β-氧化，导致其在体内积累。尚未测试体内碱基编辑或先导编辑是否可用于改善ALD。我们通过将含有致病突变的人cDNA插入小鼠Abcd1基因座，开发了ALD的人源化小鼠模型。人源化ALD模型显示出VLCFA水平升高。为了纠正该突变，我们测试了碱基编辑和先导编辑，发现使用ABE8e(V106W)进行碱基编辑可以在患者来源的成纤维细胞中以7.4%的效率纠正该突变。腺相关病毒（AAV）介导的NG-ABE8e(V106W)全身递送使得小鼠大脑（校正效率：约5.5%）、脊髓（约5.1%）和肾上腺（约2%）中的致病突变得到有效校正，导致血浆中C26:0/C22:0水平显著降低。该人源化小鼠模型的建立以及使用碱基编辑器成功校正致病突变，是治疗人类ALD疾病的重要一步。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否通过体内碱基编辑或先导编辑纠正ALD患者的ABCD1 p.G512S（c.1534G>A）突变，并改善疾病表型？
- 核心机制
- 使用腺嘌呤碱基编辑器NG-ABE8e(V106W)实现ABCD1突变位点的A-to-G校正，恢复ABCD1功能，促进VLCFAs进入过氧化物酶体进行β-氧化，降低血浆中C26:0/C22:0比值。
- 主要证据
- 在人源化hALD小鼠模型中，全身递送AAV-PHP.B-split-NG-ABE8e(V106W)和gx19 sgRNA后，脑、脊髓、肾上腺等器官检测到基因校正（基因组DNA效率高达5.5%，cDNA效率高达10%），并伴随血浆C26:0/C22:0显著降低（高剂量组降低49%）。
- 研究意义
- 该研究建立的hALD小鼠模型和体内碱基编辑策略为ALD的基因治疗提供了临床前平台，并为其他遗传性疾病的模型构建和基因治疗提供了参考。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估hALD小鼠模型的VLCFA表型
验证hALD小鼠模型是否表现出ALD相关的生化特征，即组织中VLCFA水平的增加。
通过LC-MS/MS分析9月龄hALD和WT小鼠的脑、肝、睾丸中的C22:0、C24:0、C24:0/C22:0、C26:0、C26:0/C22:0水平，并比较两组间的差异。
体外筛选最优pegRNA和sgRNA
通过高通量筛选从大量pegRNA中选出对ABCD1 c.1534G>A突变校正效率最高的pegRNA，同时评估不同sgRNA与ABE的编辑效率，选择最优的编辑工具和向导。
构建包含97对pegRNA和目标序列的质粒库，生成慢病毒库，转导PE2表达HEK293T细胞，经过7天筛选后提取基因组DNA，进行靶向深度测序分析编辑效率。同时，构建三种sgRNA（x19、gx19、gx20）与NG-ABE8e(V106W)的split表达质粒，电穿孔患者成纤维细胞，5天后深度测序评估A-to-G编辑效率。
体外验证碱基编辑和先导编辑在患者细胞中的效率
确定最优pegRNA和sgRNA在患者来源成纤维细胞中的实际编辑效率，比较碱基编辑和先导编辑的效率。
将最优的三种pegRNA（Ram_ALD_10117、10111、10105）与PE2max质粒电穿孔患者成纤维细胞，3天后检测编辑效率。同时将split-NG-ABE8e(V106W)质粒和gx19 sgRNA电穿孔患者成纤维细胞，5天后检测A-to-G编辑效率，并与先导编辑效率比较。
评估脱靶效应
评估选定的gx19 sgRNA在患者成纤维细胞和293T-target细胞中的脱靶编辑情况，并评估转录组水平的RNA脱氨活性。
使用Cas-OFFinder预测8个潜在脱靶位点（OT1-OT8），并使用Digenome-seq鉴定9个额外位点（OFF01-OFF09）。在患者成纤维细胞和293T-target细胞中验证编辑效率，并通过RNA测序检测转录组范围的A-to-I编辑水平。
体内递送AAV-PHP.B-split-NG-ABE8e(V106W)并检测基因校正效率
评估AAV-PHP.B介导的split-NG-ABE8e(V106W)在hALD小鼠中的系统性递送是否能在不同器官中实现有效的基因编辑。
通过尾静脉注射低剂量（1.0×10^12 vg/载体）或高剂量（6.4×10^12 vg/载体）的AAV-PHP.B-N/AAV-PHP.B-C载体至6周龄hALD小鼠，6周后取各器官，提取基因组DNA和RNA，通过靶向深度测序检测基因组和cDNA中的A-to-G编辑效率。
评估基因编辑对VLCFA水平的影响
评估AAV介导的碱基编辑是否改善hALD小鼠的生化表型，即降低血浆中VLCFA水平。
在12周龄AAV处理（高/低剂量）、未处理和野生型小鼠中，通过LC-MS/MS测量血浆C26:0/C22:0和C26:0水平，比较各组间的差异。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
体外编辑效率评估
体内递送与疗效评估
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 质粒构建 | pX552载体 | Addgene | 107023 |
| pCMV-PEmax-P2A-BSD质粒 | Addgene | 174821 | |
| 骨架载体 | Addgene | 137177 | |
| 骨架载体 | Addgene | 137178 | |
| 质粒 | Addgene | 198533 | |
| pEGFP-puro质粒 | Addgene | 45561 | |
| Lenti_gRNA-Puro载体 | Addgene | 84752 | |
| 慢病毒生产 | psPAX2 | Addgene | 12260 |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| AAV生产 | pHelper质粒 | Cell BioLabs | VPK-402 |
| PHP.B衣壳质粒 | Addgene | 103002 | |
| 蛋白质表达与纯化 | pET-Cas9-NG质粒 | 文中未明确说明 | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 青霉素 | Gibco | -- | |
| 链霉素 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 慢病毒生产 | 氯喹二磷酸盐 | 文中未明确说明 | -- |
| 聚乙烯亚胺 | 文中未明确说明 | -- | |
| 试剂 | 嘌呤霉素 | Invitrogen | -- |
| TRIzol试剂 | Invitrogen | AM1345 | |
| TRIzol试剂 | Invitrogen | -- | |
| AccuPower RT预混液 | Bioneer | -- | |
| SYBR Green染料 | Applied Biosystems | -- | |
| Q5高保真DNA聚合酶 | New England Biolabs | -- | |
| Phusion聚合酶 | New England Biolabs | -- | |
| T7核酸内切酶1 | New England Biolabs | -- | |
| NEBuilder HiFi DNA组装试剂盒 | New England Biolabs | -- | |
| 试剂盒 | mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra RNA合成试剂盒 | Invitrogen | AM1345 |
| MEGAclear试剂盒 | Invitrogen | AM1908 | |
| Wizard基因组DNA纯化试剂盒 | Promega | -- | |
| G-DEX基因组DNA提取试剂盒 | iNtRON Biotechnology | -- | |
| DNeasy组织试剂盒 | QIAGEN | -- | |
| MEGAquick-spin总片段DNA纯化试剂盒 | iNtRON Biotechnology | -- | |
| Illumina TruSeq链式mRNA样本制备试剂盒 | Illumina | -- | |
| 分析仪器 | 液相色谱-质谱联用系统 | Agilent/AB Sciex | -- |
| NovaSeq测序平台 | Illumina | -- | |
| MiniSeq测序平台 | Illumina | -- | |
| Illumina HiSeq X Ten测序仪 | Illumina | -- | |
| D1000 TapeStation系统 | Agilent | -- | |
| Neon转染系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| NanoDrop系统 | 文中未明确说明 | -- | |
| 试剂 | 碘克沙醇 | Sigma | D1556 |
| 二十六酸-d4溶液 | CDN Isotopes | -- | |
| AABD-SH | Tokyo Chemical Industry | -- | |
| TPP | Sigma-Aldrich | -- | |
| DPDS | Sigma-Aldrich | -- | |
| 牛血清白蛋白 | 文中未明确说明 | -- | |
| 核糖核酸酶A | 文中未明确说明 | -- | |
| 异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷 | 文中未明确说明 | -- | |
| 卡那霉素 | 文中未明确说明 | -- | |
| Tris-HCl | Roche | -- | |
| 氯化钠 | Sigma | -- | |
| 二硫苏糖醇 | Roche | -- | |
| 咪唑 | Samchun | -- | |
| 甘油 | Samchun | -- | |
| 溶菌酶 | Sigma | -- | |
| Triton | 文中未明确说明 | -- | |
| 甲醇 | 文中未明确说明 | -- | |
| 盐酸 | 文中未明确说明 | -- | |
| 己烷 | 文中未明确说明 | -- | |
| 氯仿 | 文中未明确说明 | -- | |
| 乙醇 | 文中未明确说明 | -- | |
| 二甲苯 | 文中未明确说明 | -- | |
| 伊红 | 文中未明确说明 | -- | |
| 马血清促性腺激素 | 文中未明确说明 | -- | |
| 人绒毛膜促性腺激素 | 文中未明确说明 | -- | |
| 动物实验 | 异氟烷 | 文中未明确说明 | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| hALD小鼠模型构建 | TILD-CRISPR技术细节：sgRNA（RG2）序列、Cas9 mRNA浓度、供体DNA浓度、胚胎移植步骤；需要核对F0和F1代的基因型确认方法 阅读提示：见Materials and methods 'Generation of the mouse model'和Result 'Generation and evaluation of a humanized mouse model of ALD'。 |
| 体外碱基编辑 | ABE变体（NG-ABE8e(V106W)）和sgRNA（gx19）的序列；电穿孔条件（细胞数、质粒量、电压、宽度、脉冲数）；编辑效率检测时点 阅读提示：见Materials and methods 'Electroporation of patient-derived fibroblasts'和Result 'Evaluation of NG-ABE8e_V106W activity in patient-derived fibroblasts'。 |
| 脱靶效应评估 | 脱靶位点预测工具（Cas-OFFinder、Digenome-seq）的具体参数；验证细胞系（患者成纤维细胞、293T-target）；编辑效率检测方法 阅读提示：见Materials and methods 'Analysis of off-target effects'和Result 'Genome-wide and transcriptome-wide off-target effects of the ABE'。 |
| 体内AAV递送 | AAV载体构建细节（split-intein系统）；AAV剂量（高剂量6.4×10^12 vg，低剂量1.0×10^12 vg）；注射方式（尾静脉）；分析时间点（6周后） 阅读提示：见Materials and methods 'AAV production'和'AAV delivery into hALD mice'，以及Result 'In vivo adenine base editing with NG-ABE8e_V106W results in successful therapeutic gene correction in the hALD model'。 |
| VLCFA分析 | LC-MS/MS方法、内标（hexacosanoic-d4）、样品前处理（Folch/Bligh-Dyer）、定量指标（C26:0/C22:0, C26:0） 阅读提示：见Materials and methods 'VLCFA analysis with liquid chromatography-tandem mass spectrometry'。 |
| 统计分析 | 统计方法（t检验、单因素方差分析）、样本量（n=3）、多重比较校正 阅读提示：见Materials and methods 'Statistical analysis'。 |