验证ACE2是多种冠状病毒的通用受体
验证ACE2是否介导多种冠状病毒刺突蛋白（SP）进入宿主细胞。
在BEAS-2B细胞中过表达人ACE2（N740），检测七种冠状病毒SP（HCoV-NL63, SARS-CoV, SARS-CoV-2, MERS-CoV, HCoV-HKU1, HCoV-229E, HCoV-OC43）的细胞进入情况，并在加入外源hrACE2后观察阻断效果。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
一种消除心脏毒性的ACE2变体作为冠状病毒入侵细胞的泛抑制剂
A cardiotoxicity-eliminated ACE2 variant as a pan-inhibitor against coronavirus cell invasion
实验完整度
高包含细胞实验（ACE2过表达促进SP入侵、hrACE2阻断）、体内动物模型（仓鼠SP滴鼻模型、小鼠心脏毒性评估）以及RNA-seq、Western blot、IHC等多层级验证。
主要模型
BEAS-2B人肺上皮细胞系 AC16人心肌细胞系 新生大鼠成纤维细胞 金黄叙利亚仓鼠SP滴鼻模型 FVB小鼠模型
重点核对
hrACE2-4mu（H345/374/378/505L）突变是否消除心脏毒性 hrACE2-4mu与WT hrACE2对多种冠状病毒SP阻断活性的比较 仓鼠模型中SP滴鼻给药剂量及hrACE2-4mu预处理剂量（1 mg/kg） FVB小鼠中hrACE2-mFc和hrACE2-4mu-mFc注射剂量（1 mg/kg/天，持续4周） SP阻断实验中hrACE2蛋白浓度（1 μg/mL）
摘要
人重组ACE2（hrACE2）一直被视为COVID-19治疗的有效候选药物，但其潜在的心脏副作用引起了许多担忧。在此，我们开发了一种消除心脏毒性的hrACE2变体，该变体在hrACE2内具有四个突变位点（H345L、H374L、H378L、H505L），命名为hrACE2-4mu。hrACE2-4mu与变异SARS-CoV-2刺突蛋白（SPs）具有一致的结合亲和力，并能有效阻断SP诱导的SARS-CoV-2进入细胞。在金黄仓鼠中，注射纯化的野生型（WT）hrACE2可挽救由WT、delta和omicron变异株的SP引起的早期肺炎，并减少炎症细胞浸润。然而，长期注射WT hrACE2会诱导不希望的心脏纤维化，如纤连蛋白和胶原蛋白表达上调所示。我们新开发的hrACE2-4mu在阻断一系列冠状病毒入侵细胞方面表现出与WT hrACE2相似的保护能力，同时不会引起明显的心脏副作用。因此，我们生成了一种消除心脏毒性的hrACE2变体，作为冠状病毒入侵细胞的泛抑制剂，为治疗COVID-19和其他冠状病毒提供了一种潜在的新策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否通过突变ACE2的关键组氨酸位点消除其心脏毒性，同时保持其广谱阻断冠状病毒细胞入侵的能力？
- 核心机制
- ACE2的四个组氨酸位点（H345、H374、H378、H505）是其酶活性和触发心脏纤维化的关键，突变这些位点（4mu）可消除ACE2诱导的心脏纤维化，而不影响其与刺突蛋白的结合及阻断能力。
- 主要证据
- 在AC16细胞和新生大鼠成纤维细胞中，ACE2过表达促进纤维化蛋白表达，而4mu突变可阻断此效应；在FVB小鼠中，hrACE2-4mu-mFc注射不引起心脏纤维化，且与WT hrACE2同样能保护仓鼠免受SP诱导的肺部损伤。
- 研究意义
- 该研究提供了一种潜在的COVID-19和其他冠状病毒治疗新策略，即使用无心脏毒性的hrACE2-4mu作为泛抑制剂。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
比较hrACE2与中和抗体的阻断效力
评估hrACE2对变异SP的阻断能力是否优于中和抗体。
将不同变异SP（WT, E484K, N501Y, D614G, L452R, K417N/E484K/N501Y, L452Q/F490S, S477N/E484K）与hrACE2或中和抗体（40150-D001）共同孵育，检测SP进入BEAS-2B细胞的情况。
评估hrACE2-mFc在仓鼠体内的保护作用
在体内模型中验证hrACE2能否阻断SP诱导的肺部损伤。
对金黄叙利亚仓鼠进行SP鼻滴（WT、delta、omicron），并在鼻滴前30分钟腹腔注射hrACE2-mFc（1 mg/kg），24小时后分析肺部病理变化、炎症细胞浸润和细胞因子水平。
确认WT hrACE2的心脏毒性及突变体的改善
验证WT hrACE2是否引起心脏纤维化，并筛选能消除毒性的突变体。
在AC16细胞和新生大鼠成纤维细胞中过表达ACE2并施加病理刺激（AngII或Ang1-7），检测纤维化蛋白表达；在FVB小鼠中注射hrACE2-mFc或hrACE2-4mu-mFc（1 mg/kg/天，一周），分析心脏形态和纤维化标志物。
验证hrACE2-4mu与WT的等同阻断活性
确认4mu突变体在阻断SP进入方面与WT hrACE2等效。
用不同hrACE2突变体（包括N76、N360、N615单点、双点、四点突变）与SP孵育后加入BEAS-2B细胞，检测SP进入情况；在仓鼠体内比较hrACE2-4mu-mFc与WT的保护效果。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白纯化 | Ni-NTA琼脂糖珠 | Changzhou Smart-Lifesciences Biotechnology Co., Ltd. | -- |
| 显色基质法鲎试剂盒 | Solabio Life Science | T7571 | |
| 细胞培养 | BEAS-2B | ATCC | CRL-9609 |
| AC16 | MeisenCTCC | ctcc-003-0014 | |
| 胎牛血清 | VisTech | SE100-011 | |
| DMEM培养基 | Gibco | 8123301 | |
| ACE2过表达腺病毒 | OBiO Technology | H15800 | |
| 药物处理 | 血管紧张素II | Sigma | 05-23-0101 |
| 血管紧张素1-7 | MCE | 51833-78-4 | |
| Western blot | 抗GAPDH抗体 | Bioeasy Technology | BE0034-100 |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Bioeasy Technology | BE0037-100 | |
| 抗ACE2抗体 | Proteintech | 21115-1-AP | |
| 抗纤连蛋白抗体 | Proteintech | 15613-1-AP | |
| 抗胶原蛋白1A抗体 | Proteintech | 14695-1-AP | |
| 抗HIS抗体 | Jackson ImmunoResearch | 300-005-240 | |
| 抗野生型SP抗体 | Sino Biological | 40592-T62 | |
| 野生型SP中和抗体 | Sino Biological | 40150-D001 | |
| 抗delta SP和抗omicron SP抗体 | Sino Biological | 40592-MM117 | |
| 组织学分析 | 天狼星红染色试剂盒 | Baso Diagnostic, Inc. | BA-4081 |
| 抗CD3抗体 | ZSGB-BIO | ZM-0417 | |
| 抗纤连蛋白抗体 | Proteintech | 15613-1-AP | |
| 抗TNFα抗体 | Proteintech | 60291-1-Ig | |
| 抗IL-6抗体 | Proteintech | 21865-1-AP | |
| 抗delta SP和抗omicron SP抗体 | Sino Biological | 40592-MM117 | |
| 显微成像 | EVOS FL Auto显微镜 | Thermo Fisher Scientific | AMAFD1000 |
| SP RBD购买 | 刺突蛋白受体结合域 | CUSABIO | CSB-YP747509HIX, |
| 动物实验 | 异氟烷 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 蛋白纯化 | SP蛋白表达细胞系（HEK293T）、纯化方法、内毒素去除方法 阅读提示：Materials and methods, Protein purification |
| 细胞培养与SP入侵实验 | BEAS-2B细胞培养条件、ACE2过表达方式、SP孵育时间、hrACE2浓度 阅读提示：Materials and methods, Cell culture; Figure Legends 1A-1D |
| 动物模型 | 仓鼠品系、年龄、性别、SP鼻滴剂量（1 mg/kg）、hrACE2预处理剂量（1 mg/kg，腹腔）、处理时间（30min）、取材时间（24h） 阅读提示：Materials and methods, Animal studies; Figure Legends 1E-1H |
| 心脏毒性评估 | FVB小鼠品系、年龄、性别、hrACE2-mFc或hrACE2-4mu-mFc注射剂量（1 mg/kg/天）、持续时间（1周或4周）、心脏组织处理 阅读提示：Materials and methods, Animal studies; Figure Legends 2F-2I |
| 阻断实验 | hrACE2突变体浓度（1 μg/mL）、SP浓度、处理时间 阅读提示：Materials and methods, Cell culture; Figure Legends 3A-3B |