验证小胶质细胞在OIR中的作用
确定小胶质细胞对视网膜新生血管形成的影响
建立OIR模型，使用PLX3397清除小胶质细胞，观察视网膜新生血管变化
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小胶质细胞中YY1乳酸化通过转录激活上调FGF2促进血管生成
YY1 lactylation in microglia promotes angiogenesis through transcription activation-mediated upregulation of FGF2
实验完整度
高包含OIR模型、细胞系、乳酸化组学、功能验证及体内外机制研究等至少两个证据层级。
主要模型
氧诱导视网膜病变小鼠模型 HMC3人小胶质细胞系 HRMEC人视网膜微血管内皮细胞
重点核对
PLX3397腹腔注射剂量1mg/(kg day)，给药时间P10-P17 DCA剂量200mg/(kg day)，腹腔注射，P13-P16 鱼藤酮剂量1.5mg/(kg day)，腹腔注射，P13-P16 缺氧处理HMC3细胞1%O2下12或24小时 A485浓度200μM，每眼1μl，玻璃体内注射P14
摘要
背景
眼新生血管是致盲的主要原因。视网膜小胶质细胞与缺氧诱导的血管生成和血管病变有关，但其潜在机制尚不完全清楚。乳酸化是一种新型的源于乳酸的翻译后修饰，在多种细胞过程中发挥关键作用。由于缺血性视网膜病变中的缺氧是视网膜新生血管的诱发因素，乳酸化很可能参与这一过程。本研究旨在探讨乳酸化在视网膜新生血管中的作用，并确定视网膜新生血管疾病的新治疗靶点。
结果
通过集落刺激因子1受体（CSF1R）抑制剂PLX3397清除小胶质细胞可抑制氧诱导视网膜病变中的视网膜新生血管。缺氧增加了小胶质细胞中的乳酸化并加速FGF2表达，促进视网膜新生血管形成。我们在缺氧条件下乳酸增加的情况下鉴定出67种蛋白质的77个乳酸化位点增加。我们的结果表明，非组蛋白转录因子阴阳1（YY1）在赖氨酸183（K183）位点被乳酸化，该位点受p300调控。高乳酸化的YY1直接增强FGF2转录并促进血管生成。YY1 K183突变消除了这些效应。过表达p300可增加YY1乳酸化并在体外增强血管生成，而给予p300抑制剂A485在体内和体外均能显著抑制血管生成。
结论
我们的结果表明，小胶质细胞中YY1乳酸化通过上调FGF2表达在视网膜新生血管形成中发挥重要作用。靶向乳酸/p300/YY1乳酸化/FGF2轴可能为增殖性视网膜病变提供新的治疗靶点。
补充信息
在线版本包含补充材料，可在10.1186/s13059-023-02931-y获取
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 视网膜新生血管形成中，小胶质细胞的乳酸化是否参与调控及机制为何？
- 核心机制
- 缺氧促进小胶质细胞中p300介导的YY1在K183位点的乳酸化，增强YY1与FGF2启动子结合，从而促进FGF2转录和血管生成。
- 主要证据
- 在OIR模型和HMC3细胞中，检测到乳酸化水平升高；通过乳酸化组学鉴定YY1 K183位点；K183R突变降低YY1结合和FGF2表达；p300过表达增加YY1乳酸化，A485抑制则降低，并影响血管生成。
- 研究意义
- 研究揭示乳酸/p300/YY1乳酸化/FGF2轴在视网膜新生血管中的作用，为增殖性视网膜病变提供潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
分析乳酸化水平与视网膜新生血管的关系
探究乳酸化和乳酸水平在OIR中的作用
检测OIR小鼠视网膜乳酸含量和Pan-Kla水平，并用DCA和鱼藤酮调节乳酸水平观察新生血管变化
体外验证小胶质细胞乳酸化对血管生成的作用
探究缺氧诱导的小胶质细胞乳酸化是否能促进内皮细胞血管生成能力
将缺氧处理的HMC3细胞与HRMECs共培养，通过管形成、球状出芽、迁移和增殖实验评估内皮细胞血管生成能力
鉴定乳酸化靶蛋白并验证YY1乳酸化
寻找缺氧下乳酸化水平变化的蛋白质并鉴定关键靶点
通过乳酸化组学和蛋白质组学分析鉴定差异乳酸化蛋白，并通过质谱验证YY1 K183位点
验证YY1乳酸化对内皮细胞血管生成功能的影响
评估YY1乳酸化在小胶质细胞促进血管生成中的作用
将过表达YY1 WT或K183R突变的HMC3细胞与HRMECs共培养，观察血管生成能力变化
阐明YY1乳酸化调控FGF2表达的分子机制
揭示YY1乳酸化如何影响FGF2转录
通过ChIP-qPCR检测YY1与FGF2启动子结合，双荧光素酶报告基因检测转录活性
确定p300在YY1乳酸化中的作用
验证p300是否作为YY1乳酸化的调控因子
通过Co-IP检测p300与YY1相互作用，过表达p300或使用A485抑制p300，检测YY1乳酸化和FGF2表达
体内验证p300抑制治疗效果
评估p300抑制剂A485在OIR模型中的治疗效果
玻璃体内注射A485，评估YY1乳酸化、FGF2表达和视网膜新生血管面积
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 小胶质细胞清除 | PLX3397 | MedChemExpress | HY-16749 |
| 药物处理 | 鱼藤酮 | Rhawn | R006873 |
| 血管生成验证 | 重组小鼠FGF2 | R&D Systems | 3139-FB |
| 药物处理 | A-485 | -- | -- |
| 细胞培养 | EMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| Complete Classic Medium with Serum & CultureBoost | Cell Systems | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| 乳酸检测 | 乳酸检测试剂盒 | Solarbio | BC2230 |
| 免疫荧光 | CD31抗体 | Abcam | ab9498 |
| Iba1抗体 | WAKO | 019-19741 | |
| 泛赖氨酸乳酸化抗体 | PTM Bio | PTM-1401 | |
| YY1-K183la抗体 | PTM Bio | -- | |
| YY1抗体 | Proteintech | 66281-1-Ig | |
| p300抗体 | Santa Cruz | sc-48343 | |
| Ki67抗体 | Abcam | ab16667 | |
| Alexa Fluor 488偶联二抗 | Beyotime | A0423 | |
| Cy3偶联二抗 | Beyotime | A0516 | |
| Alexa Fluor 647偶联二抗 | Beyotime | A0473 | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | -- | -- |
| qPCR逆转录预混液 | MCE | HY-K0510 | |
| SYBR Green qPCR预混液 | MCE | HY-K0501 | |
| Western blotting | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013B |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0012S | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| ECL化学发光试剂盒 | Advansta | -- | |
| 泛赖氨酸乳酸化抗体 | PTM Bio | PTM-1401 | |
| YY1-K183la抗体 | PTM Bio | -- | |
| YY1抗体 | Cell Signaling | 46395S | |
| SIRT1抗体 | Abcam | ab7343 | |
| PCAF抗体 | Abcam | ab12188 | |
| FGF2抗体 | Santa Cruz | sc-74412 | |
| p300抗体 | Santa Cruz | sc-48343 | |
| HDAC6抗体 | Santa Cruz | sc-28386 | |
| TIP60抗体 | Santa Cruz | sc-166323 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Proteintech | 20536-1-AP | |
| VeriBlot免疫沉淀检测试剂(HRP) | Abcam | ab131366 | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | 11668019 |
| 乳酸化组学 | PTM Bio珠子 | PTM Bio | -- |
| C18 ZipTips | Millipore | -- | |
| nanoElute超高效液相色谱系统 | Bruker Daltonics | -- | |
| timsTOF Pro质谱仪 | Bruker Daltonics | -- | |
| 免疫共沉淀 | 免疫沉淀试剂盒 | Abcam | ab206996 |
| ChIP | SimpleChIP Plus酶法染色质免疫沉淀试剂盒 | CST | 9004S |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | CST | -- | |
| 抗IgG抗体 | CST | 3900 | |
| 双荧光素酶报告基因 | 双荧光素酶报告基因检测试剂盒 | Promega | E2920 |
| 管形成实验 | Matrigel基质胶 | Corning | -- |
| Transwell迁移 | 8μm孔径Transwell小室 | Corning | 3422 |
| HRMEC增殖 | 0.3μm孔径Transwell小室 | Corning | 3413 |
| 细胞培养 | 支原体检测试剂盒 | Applied Biosystems | 4460623 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| OIR模型建立 | C57BL/6J小鼠P7-P12置于75%±2%氧气环境中，随后回到正常空气至P17 阅读提示：Methods: Induction of OIR |
| 小胶质细胞清除 | PLX3397剂量: 1mg/(kg day)，腹腔注射，P10-P17 阅读提示：Methods: Microglial depletion |
| 药物处理 | DCA剂量: 200mg/(kg day)，鱼藤酮剂量: 1.5mg/(kg day)，均为腹腔注射，P13-P16 阅读提示：Methods: Animal treatment |
| 体外缺氧处理 | HMC3细胞在1%O2条件下处理0、12、24小时 阅读提示：Results: Hyperlactylation of microglia promotes angiogenesis in vitro; Methods: Cell lines and cell cultures |
| 共培养体系 | HMC3细胞预处理24小时（条件包括DCA 20mM、鱼藤酮50nM、A-485浓度0、5、10、20μM）后与HRMECs共培养 阅读提示：Methods: Cell lines and cell cultures; HRMECs tube formation assay |
| YY1突变体构建 | 使用慢病毒构建Flag-YY1 WT和K183R突变体，MOI=30 阅读提示：Methods: In vitro lentivirus infection and plasmid transfection |
| p300抑制实验 | A-485浓度200μM，每眼1μl，玻璃体内注射，OIR小鼠P14 阅读提示：Methods: Animal treatment; Results: Inhibiting p300 reduces... |
| 乳酸检测 | 使用LA Assay Kit检测视网膜和细胞裂解液乳酸含量，按说明书操作 阅读提示：Methods: Quantification of lactate levels |
| 乳酸化修饰检测 | 使用Pan-Kla和YY1-K183la抗体进行Western blot和免疫荧光检测 阅读提示：Methods: Western blotting; Immunofluorescence |
| ChIP-qPCR | 使用SimpleChIP Plus试剂盒，anti-YY1抗体，FGF2启动子区域-1336至-1172引物 阅读提示：Methods: ChIP assay |
| 双荧光素酶报告基因 | FGF2启动子克隆到荧光素酶载体，共转染YY1 WT或K183R，缺氧处理24小时 阅读提示：Methods: Luciferase activity assays |
| 统计分析 | 数据以mean±SD表示，两组比较用Student's t检验或Mann-Whitney U检验，多组用one-way ANOVA及Bonferroni事后检验，p<0.05为显著 阅读提示：Methods: Statistical analysis |