沙漠lncRNA鉴定与特征分析
系统研究沙漠lncRNA的表达、定位和细胞特异性，并鉴定关键候选HIDEN。
基于GENCODE V29注释将lncRNA分为重叠、近端和沙漠三类。重新分析多个RNA-seq数据集，比较ESC和DE细胞中表达差异，计算表达水平、亚细胞定位（RCI）和阶段特异性分数，筛选出HIDEN并验证其表达模式。
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沙漠lncRNA HIDEN通过相互作用IMP1和稳定FZD5 mRNA调控人内胚层分化
A desert lncRNA HIDEN regulates human endoderm differentiation via interacting with IMP1 and stabilizing FZD5 mRNA
实验完整度
高包含细胞实验（PSC分化、基因敲除/敲低）、生化实验（RNA pulldown、RIP、EMSA）、转录组测序及功能回复实验，多层级验证机制。
主要模型
人胚胎干细胞系HUES8 人胚胎干细胞系H9 人诱导多能干细胞系PGP1 HEK293T细胞
重点核对
HIDEN敲除效率（基因组PCR和RT-qPCR验证） HIDEN/IMP1/FZD5敲除或敲低后内胚层分化效率（流式、免疫荧光、Western blot、RT-qPCR） HIDEN与IMP1的物理相互作用（RNA pulldown、RIP、EMSA） WNT信号活性（活性β-catenin水平、TCF荧光素酶报告基因） FZD5 mRNA稳定性（放线菌素D转录抑制实验）
摘要
背景：大量研究已经揭示了lncRNA在发育和分化中的功能和机制，但大多数研究集中在与蛋白编码基因邻近的lncRNA上。相反，位于基因沙漠中的lncRNA很少被探索。在这里，我们利用多种分化系统来剖析一个沙漠lncRNA HIDEN（人类IMP1相关“沙漠”定型内胚层lncRNA）在人多能干细胞定型内胚层分化中的作用。结果：我们显示沙漠lncRNA在干细胞分化过程中以细胞阶段特异性模式高表达，并具有保守的亚细胞定位。然后我们聚焦于沙漠lncRNA HIDEN，它在人内胚层分化过程中上调并发挥重要作用。我们发现通过shRNA或启动子缺失耗竭HIDEN显著损害人内胚层分化。HIDEN与RNA结合蛋白IMP1（IGF2BP1）功能性相互作用，后者也是内胚层分化所必需的。HIDEN或IMP1的缺失导致WNT活性降低，WNT激动剂可以挽救由HIDEN或IMP1缺失引起的内胚层分化缺陷。此外，HIDEN缺失减少了IMP1蛋白与FZD5 mRNA之间的相互作用，并导致FZD5 mRNA的不稳定，FZD5是WNT受体，对定型内胚层分化是必需的。结论：这些数据表明，沙漠lncRNA HIDEN促进IMP1与FZD5 mRNA的相互作用，稳定FZD5 mRNA，从而激活WNT信号并促进人定型内胚层分化。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 沙漠lncRNA HIDEN在人定型内胚层分化中的功能及其调控机制是什么？
- 核心机制
- HIDEN与RNA结合蛋白IMP1相互作用，通过其KH3-4结构域结合HIDEN的251-650nt区域，增强IMP1与FZD5 mRNA的结合，稳定FZD5 mRNA，从而激活WNT/β-catenin信号，促进内胚层分化。
- 主要证据
- 敲除HIDEN或IMP1导致内胚层分化缺陷，WNT激动剂CHIR-99021可部分挽救；HIDEN缺失减少IMP1与FZD5 mRNA的结合并降低FZD5 mRNA稳定性；敲除FZD5同样阻断内胚层分化。
- 研究意义
- 首次揭示了功能性沙漠lncRNA HIDEN在人内胚层分化中的作用，为理解细胞命运决定提供了新见解，并为内胚层来源功能细胞或组织的有效获取提供了理论依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
HIDEN全长克隆与敲除细胞系建立
确定HIDEN转录本信息，并建立敲除细胞系以研究其功能。
通过RACE获得HIDEN全长（1045nt），并利用CRISPR/Cas9在PGP1细胞中删除启动子和第一外显子构建HIDEN敲除系，验证敲除效率和多能性维持。
HIDEN缺失对DE分化影响的功能实验
评估HIDEN敲除或敲低对内胚层分化的影响。
对野生型和HIDEN-KO/KDPSC进行DE分化，通过流式、免疫荧光、Western blot和RT-qPCR检测内胚层标志物（SOX17、FOXA2、CXCR4）及多能性标志物，并进行EB分化和胰腺谱系分化验证。
HIDEN相互作用蛋白鉴定
寻找介导HIDEN功能的RNA结合蛋白。
通过RNA pulldown结合质谱鉴定HIDEN相互作用蛋白，发现IMP1/2/3，并用Western blot、RIP验证HIDEN与IMP1的结合。进一步通过截短突变和EMSA定位结合区域。
IMP1功能验证
确定IMP1在内胚层分化中的必要性。
通过CRISPR/Cas9在H9细胞中敲除IMP1，并利用shRNA敲低，进行DE分化，检测内胚层标志物。
WNT信号通路作为HIDEN/IMP1下游
验证HIDEN/IMP1是否通过WNT信号调控DE分化。
在HIDEN-KO DE细胞中检测活性β-catenin水平，并用CHIR-99021激活WNT或Wnt-C59抑制WNT，观察对DE分化的影响；同时用TCF荧光素酶报告基因检测HIDEN过表达和IMP1过表达的效果。
靶基因FZD5的鉴定与功能验证
寻找HIDEN/IMP1调控WNT信号的具体靶基因，并验证其功能。
结合WNT相关基因列表、DE分化差异基因和IMP1 RIP-seq数据，筛选出FZD5和LGR5。重点研究FZD5，通过RT-qPCR、RIP、RNA稳定性实验验证HIDEN/IMP1对FZD5 mRNA稳定性调控，并敲除FZD5进行功能实验。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | mTeSR™培养基 | STEMCELL Technologies | 05850 |
| 基质胶 | -- | -- | |
| DMEM培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | 10270-106 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140163 | |
| 内皮分化 | IMDM培养基 | Gibco | C12440500BT |
| F12培养基 | Gibco | C11765500BT | |
| 牛血清白蛋白 | YEASEN | 36106ES76 | |
| B27添加剂（不含维生素A） | Shanghai BasalMedia Technologies | S441J7 | |
| 激活素A | PeproTech | 120-14P | |
| JNK-IN-8抑制剂 | Selleck | S4901 | |
| 胰腺分化 | MCDB131培养基 | Gibco | 10372019 |
| ITS-X添加剂 | BasalMedia | S452J7 | |
| GlutaMAX添加剂 | Gibco | 35050061 | |
| 葡萄糖 | Invitrogen | A2494001 | |
| 抗坏血酸 | Sigma | A5960 | |
| 角质细胞生长因子 | PeproTech | 100-19 | |
| IWR-1抑制剂 | Selleck | S7086 | |
| SANT1抑制剂 | Selleck | S7092 | |
| LDN193189抑制剂 | Selleck | S7507 | |
| TTNPB激动剂 | Selleck | S4627 | |
| PDBU | Sigma | P1269 | |
| EB分化 | Accutase消化液 | -- | -- |
| Y-27632抑制剂 | -- | -- | |
| 药物处理 | CHIR-99021 | Selleck | S2924 |
| Wnt-C59 | Selleck | S7037 | |
| 基因敲低 | 嘌呤霉素 | -- | -- |
| 基因敲除 | pX459质粒 | -- | -- |
| RACE | Hipure总RNA小提试剂盒 | Magen | R4111-03 |
| SMARTer RACE 5'/3'试剂盒 | TAKARA | 634858 | |
| 细胞增殖实验 | 细胞计数试剂盒 | -- | -- |
| SpectraMax i3x酶标仪 | MD | -- | |
| RT-qPCR | TriPure RNA提取试剂 | Roche | 11667165001 |
| ABScript II RT预混液 | ABclonal | RK20402 | |
| 2×SYBR Green qPCR预混液 | Bimake | B21203 | |
| CFX384实时荧光定量PCR仪 | Bio-Rad | -- | |
| 流式分析 | TrypLE消化液 | Gibco | 12604021 |
| 转录因子缓冲液套装 | BD | 562574 | |
| SOX17-Alexa488抗体 | BD | 562205 | |
| FACSCelesta流式细胞仪 | BD | -- | |
| CytoFLEX流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013C |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 4693132001 | |
| SOX17抗体 | R&D | AF1924 | |
| FOXA2抗体 | R&D | AF2400 | |
| IGF2BP1抗体 | ABclonal | A1517 | |
| IGF2BP2抗体 | ABclonal | A2749 | |
| IGF2BP3抗体 | ABclonal | A4444 | |
| GAPDH抗体 | Proteintech | 10494-1-AP | |
| H3抗体 | Proteintech | 17,168-1-AP | |
| 活性β-catenin抗体 | CST | 8814 | |
| β-catenin抗体 | CST | 8480 | |
| ECL化学发光检测试剂 | Millipore | WBUSLS0100 | |
| 免疫荧光 | OCT4抗体 | CST | 2750 |
| SOX2抗体 | BD | 561,469 | |
| NANOG抗体 | CST | 4903 | |
| SSEA4抗体 | Millipore | MAB4304 | |
| TRA-1-60抗体 | Millipore | MAB4360 | |
| PDX1抗体 | R&D | AF2419 | |
| 奥林巴斯IX53显微镜 | Olympus | -- | |
| RIP | Magna RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒 | Millipore | 17–700 |
| TRIzol试剂 | Invitrogen | 10296010 | |
| RNA pull-down | HiScribe T7高产RNA合成试剂盒 | NEB | E2040S |
| 生物素-16-UTP | Roche | 11388908910 | |
| Dynabeads MyOne链霉亲和素C1磁珠 | Invitrogen | 65001 | |
| RNA-seq | Illumina Hiseq X Ten测序平台 | Illumina | -- |
| 蛋白纯化 | pET28a质粒 | -- | -- |
| 大肠杆菌Rosetta菌株 | Shanghai Weidi Biotechnology | EC1010 | |
| Ni-NTA琼脂糖珠 | Abclonal | AS045 | |
| Amicon超滤离心管 | Merck | UFC201024 | |
| EMSA | Cy5-UTP | APExBIO | B8333 |
| Bio-Rad ChemiDoc MP成像系统 | Bio-Rad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与分化 | 所用细胞系（HUES8、H9、PGP1）及其培养条件，内胚层分化培养基成分（IMDM/F12或DMEM基底、B27、BSA、Activin A浓度等），分化时间（3-4天） 阅读提示：Methods: Cell culture and differentiation |
| HIDEN敲除 | CRISPR-Cas9敲除策略（双sgRNA、靶点位置），验证方法（基因组PCR、RT-qPCR），多能性标志物检测（OCT4、SSEA4等） 阅读提示：Methods: CRISPR-Cas9 mediated knockout, Results: HIDEN is required for endoderm differentiation |
| 内胚层分化效率检测 | 流式抗体（SOX17-Alexa488、CD184-APC）及门控策略，免疫荧光抗体及浓度，Western blot抗体及稀释度，qPCR引物序列 阅读提示：Methods: Flow cytometric analysis, Immunofluorescence staining, Western blot, Quantitative RT-qPCR |
| HIDEN/IMP1相互作用验证 | RNA pulldown使用生物素标记RNA和链霉亲和素磁珠，RIP使用IMP1抗体，EMSA探针浓度、蛋白浓度、结合条件 阅读提示：Methods: RNA pull-down, RNA immunoprecipitation (RIP), EMSA |
| WNT信号检测与干预 | 活性β-catenin及总β-catenin检测条件，CHIR-99021和Wnt-C59的使用浓度及处理时间，TCF荧光素酶报告基因实验条件 阅读提示：Results: WNT signaling pathway acts as downstream of HIDEN/IMP1, Methods: Luciferase assay (部分在补充中) |
| FZD5 mRNA稳定性 | 放线菌素D处理浓度和时间，FZD5 mRNA检测方法（RT-qPCR），IMP1 RIP分析 阅读提示：Results: HIDEN/IMP1 promotes WNT signal pathway through FZD5, Methods: RNA stability assay (放线菌素D处理未详述具体条件，需查补充材料) |