Target degradation of CASPASE-1 for alleviation of inflammation in sepsis via optogenetically engineered extracellular vesicles
包含体外细胞实验（HEK293T、RAW264.7）验证装载与降解机制，体内CLP脓毒症模型验证疗效，并通过Western blot、qPCR、ELISA、流式等多层级验证功能与机制。
HEK293T细胞（EVs生产） RAW264.7巨噬细胞（体外功能验证） C57BL/6小鼠CLP脓毒症模型（体内疗效评估）
HEK293T细胞转染PTGFRN–CRY2和CIBN–GCE–CTM质粒，蓝光暴露48小时 LPS（1 μg/mL）刺激RAW264.7细胞12小时以模拟炎症 CLP手术：75%盲肠结扎，21号针头穿孔，术后皮下注射预热盐水（50 mL/kg） EVsGCE−CTM治疗：尾静脉注射，6、12、18、24小时各一次 小鼠品系：雄性C57BL/6，8-10周龄，体重22-25 g
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证通过EXPLORs光遗传系统能否成功将GCE–CTM融合蛋白装载到EVs中，并确认EVs的基本特性。
共转染PTGFRN–CRY2和CIBN–GCE–CTM质粒至HEK293T细胞，蓝光照射48小时后收集上清，超速离心分离EVs。通过Western blot检测EVs标志物CD9、TSG101及GM130确认纯度，检测FLAG和CRY2表达确认装载效率；纳米颗粒跟踪分析测定粒径分布，透射电镜观察形态。
验证EVsGCE−CTM递送的GCE–CTM能否结合活化的CASPASE-1并将其引导至溶酶体降解。
LPS刺激RAW264.7细胞后，与EVsGCE−CTM或EVsNone共孵育。通过免疫荧光观察CASPASE-1与溶酶体（LysoTracker）共定位，使用抗FLAG磁珠进行共免疫沉淀验证CASPASE-1与CIBN–GCE–CTM融合蛋白的结合。
评估EVsGCE−CTM处理对LPS诱导的巨噬细胞炎症反应和细胞焦亡的影响。
LPS刺激RAW264.7细胞后，给予EVsGCE−CTM处理，检测CASPASE-1、IL1β、IL18、NLRP3、GSDMD蛋白表达，通过ELISA检测上清中IL1β和IL18，通过qPCR检测炎症因子mRNA水平，并通过流式细胞术检测CASPASE-1和PI双阳性细胞比例。
验证EVsGCE−CTM在脓毒症小鼠体内的生物分布及在巨噬细胞中的蓄积和CASPASE-1降解情况。
使用CLP诱导脓毒症小鼠，静脉注射DiR标记的EVs，通过IVIS成像系统观察体内分布；注射Dil标记的EVs，通过免疫荧光观察与F4/80阳性巨噬细胞共定位及细胞内CASPASE-1与溶酶体共定位。
评估EVsGCE−CTM对CLP诱导脓毒症小鼠的炎症、器官损伤和生存率的影响。
CLP小鼠在术后6、12、18、24小时尾静脉注射PBS、EVsNone或EVsGCE−CTM。通过Western blot检测多器官中cleaved CASPASE-1、IL1β、IL18、GSDMD、NLRP3表达；qPCR检测炎症因子mRNA；ELISA检测血清IL1β和IL18；流式检测CASPASE-1和PI双阳性细胞；HE染色评估组织病理；血生化检测肝肾功能、心肌酶；超声心动图评估心功能；肺功能检测；统计生存率。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | KeyGen Biotech | -- |
| RPMI 1640培养基 | HyCyte | -- | |
| 胎牛血清 | Excell Bio | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Solarbio | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Thermo | 11668030 |
| EVs分离 | 5424 R离心机 | Eppendorf | -- |
| 0.22 μm无菌滤器 | Merck Millipore | -- | |
| 超速离心机 | Beckman Coulter | A94516 | |
| EVs表征 | 醋酸铀 | Electron Microscopy Sciences | -- |
| 透射电子显微镜 | JEOL Ltd. | JEM-1400Flash | |
| Zeta View系统 | Particle Metrix | PMX 110 | |
| ELISA | 小鼠IL1β ELISA试剂盒 | MultiSciences (Lianke) Biotech | EK201B |
| 小鼠IL18 ELISA试剂盒 | MultiSciences (Lianke) Biotech | EK218 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo | 23225 | |
| 硝酸纤维素膜 | Merck Millipore | HATF00010 | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 10494-1-AP | |
| 抗GM130抗体 | Proteintech | 11308-1-AP | |
| 抗CD9抗体 | Affinity Biosciences | AF5139 | |
| 抗TSG101抗体 | Proteintech | 28283-1-AP | |
| 抗IL18抗体 | Abcam | AB207323 | |
| 抗CASPASE-1抗体 | Proteintech | 22915-1-AP | |
| 抗切割CASPASE-1抗体 | Cell Signaling Technology | #67314 | |
| 抗IL1β抗体 | Cell Signaling Technology | #31202 | |
| 抗NLRP3抗体 | Proteintech | 30109-1-AP | |
| 抗Flag抗体 | Proteintech | 66008-4-Ig | |
| 辣根过氧化物酶标记二抗 | Abcam | ab6721 | |
| ECL底物 | Thermo | 32106 | |
| qRT-PCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596026CN |
| PrimeScript第一链cDNA合成试剂盒 | Roche | 04897030001 | |
| FastStart Essential DNA Green Master | Roche | 06402712001 | |
| LightCycler 96 qPCR系统 | Roche | LightCycler 96 | |
| 动物实验 | 4-0丝线缝合线 | Ethicon | -- |
| 21号针头 | BD | -- | |
| 体内成像 | DiR荧光染料 | Invitrogen | D12731 |
| 异氟烷 | YaJi Biological | YS1414M | |
| IVIS Lumina II成像系统 | PerkinElmer | -- | |
| 组织学 | Dil荧光染料 | Invitrogen | D282 |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| 抗F4/80抗体 | Abcam | EPR26545-166 | |
| Hoechst染料 | Beyotime | C1029 | |
| 共聚焦显微镜 | Nikon | A1 Spectral | |
| 组织病理 | 甲醛 | Sigma-Aldrich | 100496 |
| 石蜡 | Sigma-Aldrich | P3558 | |
| 流式细胞术 | 碘化丙啶 | Sigma-Aldrich | P4170 |
| CASPASE-1抗体（流式） | Abcam | ab219935 | |
| 溶血实验 | 肝素化采血管 | BD | 367874 |
| 酶标仪 | BioTek Instruments | Synergy H1 | |
| 超声心动图 | Vevo 2100超声系统 | FUJIFILM VisualSonics | -- |
| 统计分析 | GraphPad Prism软件 | GraphPad Software | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| EVs生产 | HEK293T细胞转染质粒（PTGFRN–CRY2和CIBN–GCE–CTM）、蓝光波长460 nm、照射时间48小时 阅读提示：见2.1、2.2节 |
| EVs分离 | 超速离心条件：110,000×g、70分钟、4℃ 阅读提示：见2.1节 |
| 体外功能验证 | RAW264.7细胞LPS刺激浓度（1 μg/mL）和时间（12小时），EVs共孵育浓度未明确说明 阅读提示：见3.2节、图3 |
| CLP模型 | 小鼠品系、性别、年龄、体重，75%盲肠结扎，21号针穿孔，术后液体复苏剂量（50 mL/kg） 阅读提示：见2.7、2.8节 |
| 体内治疗 | EVsGCE−CTM给药剂量（文中未明确说明）、给药时间点（6、12、18、24小时）、给药方式（尾静脉注射） 阅读提示：见图6A、2.8节 |
