HiDRO技术开发与验证
建立并优化高通量DNA FISH流程，验证其检测染色质相互作用的可靠性
开发HiDRO，使用Oligopaint探针标记chr22上两个相邻TAD，通过siRNA敲低NIPBL和WAPL验证其检测已知表型的能力
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高通量Oligopaint筛选鉴定可靶向的3D基因组调控因子
High-throughput Oligopaint screen identifies druggable 3D genome regulators
实验完整度
高包含高通量筛选、siRNA验证、Hi-C、ChIP-seq、FRAP、TurboID等多种实验，从表型、机制到体内验证，证据层级丰富。
主要模型
HCT-116细胞系 HCT-116-RAD21-AID细胞系 HCT-116-WAPL-AID细胞系 人类可成药基因组siRNA文库
重点核对
siRNA敲低效率及特异性（四个独立duplex） 小分子抑制剂浓度及时间（24小时） Hi-C数据质量及生物学重复 RAD21降解效率（AID系统） 染色质结合分数（chromatin fractionation）
摘要
The human genome functions as a three-dimensional chromatin polymer, driven by a complex collection of chromosome interactions1-3. Although the molecular rules governing these interactions are being quickly elucidated, relatively few proteins regulating this process have been identified. Here, to address this gap, we developed high-throughput DNA or RNA labelling with optimized Oligopaints (HiDRO)-an automated imaging pipeline that enables the quantitative measurement of chromatin interactions in single cells across thousands of samples. By screening the human druggable genome, we identified more than 300 factors that influence genome folding during interphase. Among these, 43 genes were validated as either increasing or decreasing interactions between topologically associating domains. Our findings show that genetic or chemical inhibition of the ubiquitous kinase GSK3A leads to increased long-range chromatin looping interactions in a genome-wide and cohesin-dependent manner. These results demonstrate the importance of GSK3A signalling in nuclear architecture and the use of HiDRO for identifying mechanisms of spatial genome organization.
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 哪些人类可成药基因调控基因组三维折叠，其机制是什么？
- 核心机制
- GSK3A通过促进WAPL募集到染色质，调控cohesin卸载，从而限制染色质环化延伸并维持TAD绝缘。
- 主要证据
- HiDRO筛选、Hi-C、ChIP-seq、TurboID、共免疫沉淀等实验证明GSK3A缺失导致cohesin在CTCF位点积累、长距离环化增强。
- 研究意义
- 揭示了GSK3A信号在核结构中的重要性，并展示了HiDRO在识别空间基因组组织新机制中的效用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
可成药基因组筛选
筛选人类可成药基因组中影响TAD间相互作用的基因
使用siRNA文库对3083个基因进行敲低，通过HiDRO测量CCD和空间重叠变化，鉴定初级和验证hit
GSK3A功能验证
验证GSK3A对染色质折叠的特异性影响及其是否独立于经典WNT信号
通过siRNA敲低GSK3A和GSK3B，进行3D DNA FISH和Western blot检测beta-catenin及WNT靶基因表达
药理学抑制GSK3
验证小分子抑制剂对染色质相互作用的影响
使用非选择性GSK3抑制剂(CHIR99021, Lithium, LY2090314)和选择性抑制剂(BRD0705, BRD3731)处理细胞，进行HiDRO和3D FISH
全基因组Hi-C分析
确定GSK3A缺失对全基因组染色质结构的影响
对GSK3A敲低细胞进行原位Hi-C，分析TAD绝缘、环化及条纹变化
cohesin依赖性验证
测试GSK3A对染色质折叠的影响是否依赖cohesin
在RAD21-AID细胞系中敲低GSK3A或给予抑制剂，同时降解RAD21，通过FISH检测空间重叠
机制研究：WAPL相互作用
探究GSK3A如何调节cohesin卸载复合物
使用Western blot、共免疫沉淀、TurboID、ChIP-seq和FRAP分析GSK3A与cohesin组分的关系
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证机制链路
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | McCoy's 5A培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| L-谷氨酰胺 | -- | -- | |
| 青霉素 | -- | -- | |
| 链霉素 | -- | -- | |
| 吲哚-3-乙酸（生长素） | Sigma-Aldrich | -- | |
| 5-Ph-IAA | -- | -- | |
| Oligopaint探针合成 | Cy3 | Gold Biotechnology | B-230-1 |
| Alexa 647 | ThermoFisher Scientific | A20006 | |
| 二甲基亚砜 | -- | -- | |
| 碳酸氢钠 | -- | -- | |
| Zymo DNA清洁浓缩器-100 | Zymo | -- | |
| HiDRO DNA FISH | 384孔板 | Perkin Elmer | 6057300 |
| siRNA | Dharmacon | -- | |
| RNAiMAX转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Opti-MEM减血清培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 吐温-20 | -- | -- | |
| Triton-X | -- | -- | |
| 甲酰胺 | -- | -- | |
| 硫酸葡聚糖 | -- | -- | |
| 聚乙烯磺酸（PVSA） | -- | -- | |
| Hoescht | -- | -- | |
| 过氧化氢酶 | -- | -- | |
| 葡萄糖氧化酶 | -- | -- | |
| 3D DNA slide FISH | 多聚赖氨酸包被的玻璃载玻片 | -- | -- |
| 核糖核酸酶A | -- | -- | |
| SlowFade Gold抗淬灭剂 | Invitrogen | -- | |
| RNA干扰 | siRNA双链体 | Dharmacon | -- |
| 显微镜 | Image Xpress Micro 4高内涵显微镜 | Molecular Devices | -- |
| Image Xpress Micro 4共聚焦高内涵显微镜 | Molecular Devices | -- | |
| Leica宽场荧光显微镜 | Leica | -- | |
| Andor iXon Ultra emCCD相机 | Andor | -- | |
| Leica SP8共聚焦显微镜 | Leica | -- | |
| 免疫荧光 | RAD21抗体 | Santa Cruz | sc-166973 |
| GSK3A抗体 | Cell Signaling Technology | 4337 | |
| GSK3B抗体 | BD Biosciences | 610201 | |
| 抗鼠Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch Labs | 115-545-003 | |
| 抗兔Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch Labs | 111-605-003 | |
| DAPI染料 | -- | -- | |
| ChIP-seq | 甲醛（无甲醇） | ThermoFisher | -- |
| 甘氨酸 | -- | -- | |
| 蛋白G磁珠 | ThermoFisher | -- | |
| RAD21抗体 | Abcam | ab992 | |
| CTCF抗体 | Cell Signaling Technology | 3418 | |
| Covaris AFA管 | Covaris | -- | |
| Covaris S220超声仪 | Covaris | -- | |
| Qubit | ThermoFisher | -- | |
| NEBNext Ultra II DNA文库制备试剂盒 | NEB | -- | |
| Bioanalyzer | Agilent | -- | |
| qPCR（Kapa Biosystems） | Kapa Biosystems | -- | |
| Illumina NextSeq 500 | Illumina | -- | |
| Illumina NovaSeq 6000 | Illumina | -- | |
| Hi-C | Arima-HiC+试剂盒 | Arima Genomics | -- |
| Kapa Hyper Prep试剂盒 | Kapa Biosystems | KK8502 | |
| Qubit dsDNA HS检测试剂盒 | Invitrogen | Q32851 | |
| KAPA文库定量试剂盒 | Roche | KK4824 | |
| TapeStation 2200 | Agilent | -- | |
| 亚细胞分级和Western blot | 培养细胞亚细胞蛋白分级试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 78840 |
| RIPA缓冲液 | -- | -- | |
| Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | ThermoFisher Scientific | 23225 | |
| NuPAGE LDS样品缓冲液 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| Benzonase核酸酶 | -- | -- | |
| Mini-PROTEAN TGX免染预制胶 | Bio-Rad | -- | |
| 硝酸纤维素膜 | -- | -- | |
| β-catenin抗体 | Cell Signaling Technology | 8480 | |
| 磷酸化β-catenin Ser33/37/Thr41抗体 | Cell Signaling Technology | 9561 | |
| 磷酸化β-catenin Ser675抗体 | Cell Signaling Technology | 9567 | |
| CTCF抗体 | Santa Cruz | sc-271474 | |
| GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 5174 | |
| GSK3A抗体 | Cell Signaling Technology | 4337 | |
| GSK3B抗体 | BD Biosciences | 610201 | |
| HDAC2抗体 | Cell Signaling Technology | 5113 | |
| H3抗体 | Abcam | 1791 | |
| NIPBL抗体 | Santa Cruz | sc-374625 | |
| PDS5A抗体 | Bethyl | A300-089A | |
| RAD21抗体 | Abcam | ab992 | |
| SMC1A抗体 | Thermo Fisher Scientific | PA5-29122 | |
| WAPL抗体 | Cell Signaling Technology | 77428 | |
| 抗兔HRP标记二抗 | Cell Signaling Technology | 7074 | |
| 抗大鼠HRP标记二抗 | Cell Signaling Technology | 7077 | |
| 抗鼠HRP标记二抗 | Cell Signaling Technology | 7076 | |
| 抗鼠IRDye 800CW | LiCOR | 926-32210 | |
| 抗兔Cy3 | Jackson ImmunoResearch Labs | 111-165-003 | |
| Clarity Western ECL底物 | Bio-Rad | -- | |
| ChemiDoc MP成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| FRAP | Leica Stellaris 5共聚焦显微镜 | Leica | -- |
| Turbo-ID | MyOne链霉亲和素T1磁珠 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 生物素 | -- | -- | |
| RT-qPCR | RNeasy Plus试剂盒 | Qiagen | -- |
| Maxima逆转录酶 | Thermo Scientific | -- | |
| Oligo dT引物 | IDT | -- | |
| dNTPs | -- | -- | |
| RNase抑制剂 | Invitrogen | -- | |
| PowerUP Sybr | ThermoFisher | A25741 | |
| QuantStudio7 Flex系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 细胞系生成 | pX330-U6-Chimeric_BBCBh-hSpCas9 | Addgene | 42230 |
| G418 | -- | -- | |
| 潮霉素 | -- | -- | |
| HiDRO图像分析 | TetraSpeck微球 | Thermo Fisher Scientific | T7279 |
| 药物处理 | CHIR99021 | -- | -- |
| 锂 | -- | -- | |
| LY2090314 | -- | -- | |
| BRD0705 | -- | -- | |
| BRD3731 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | HCT-116细胞系来源（ATCC，RRID:CVCL_0291），培养基成分（McCoy's 5A补充10% FBS等），培养条件（37°C，5% CO2），AID系统的诱导剂和浓度（500 μM auxin，1 μM 5-Ph-IAA）。 阅读提示：Methods: Cell culture |
| HiDRO DNA FISH | 探针设计（80-mer，OligoMiner），探针浓度（0.1 pmol/μL），杂交温度和时间（91°C变性20分钟，37°C杂交20-24小时），洗涤条件，显像缓冲液成分。 阅读提示：Methods: HiDRO for DNA FISH |
| siRNA敲低 | siRNA浓度（25 nM），转染试剂（RNAiMAX），处理时间（72小时），细胞密度（2-3x10^3细胞/孔）。 阅读提示：Methods: RNA interference |
| 药物处理 | 抑制剂浓度（四个浓度），处理时间（24小时），溶剂对照（DMSO），生物学重复（5次）。 阅读提示：Methods: Results (GSK3i increases inter-TAD interactions), Fig. 3f legend |
| Hi-C | 起始细胞数（1x10^6），限制酶（MboI），Hi-C建库试剂盒（Arima-HiC+，Kapa Hyper Prep），测序平台和读长（单端或双端）。 阅读提示：Methods: In situ Hi-C |
| ChIP-seq | 交联条件（1%甲醛10分钟），抗体（RAD21 ab992，CTCF 3418），染色质超声条件（Covaris S220，高细胞染色质剪切15分钟），测序平台。 阅读提示：Methods: ChIP-Seq |