受体使用鉴定
确定NeoCoV和PDF-2180是否使用DPP4或其他受体进入细胞。
使用假型病毒进入实验检测NeoCoV、PDF-2180及其他merbecoviruses在表达hACE2、hDPP4或hAPN的细胞中的进入效率，并检测在表达多种蝙蝠ACE2或DPP4直系同源物的细胞中的进入能力。
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蝙蝠中MERS-CoV的近亲使用ACE2作为其功能性受体
Close relatives of MERS-CoV in bats use ACE2 as their functional receptors
实验完整度
高包含假型病毒进入测定、细胞间融合实验、RBD结合实验、冷冻电镜结构解析、突变功能验证及中和抗体评估等多个独立证据层级，并进行功能与机制验证。
主要模型
HEK293T细胞稳定表达蝙蝠ACE2直系同源物 BHK-21细胞瞬时表达人ACE2/DPP4/APN Caco-2人结肠癌细胞系 蝙蝠细胞系Tb 1 Lu
重点核对
NeoCoV和PDF-2180 S假型病毒进入表达不同蝙蝠ACE2直系同源物的HEK293T细胞 NeoCoV RBD–hFc与蝙蝠ACE2直系同源物的结合 NeoCoV RBD–Bat37ACE2复合物的冷冻电镜结构 NeoCoV T510F RBD突变对hACE2结合和假型病毒进入的影响 B6和S2P6抗体对假型病毒的中和活性
摘要
中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）和几种蝙蝠冠状病毒使用二肽基肽酶-4（DPP4）作为进入受体1-4。然而，在蝙蝠中发现的MERS-CoV最近的已知近亲NeoCoV的受体仍不清楚5。在这里，使用假型病毒进入测定，我们发现NeoCoV及其近亲PDF-2180可以通过其刺突（S）蛋白上的受体结合域（RBD）有效结合并使用特定的蝙蝠血管紧张素转换酶2（ACE2）直系同源物，以及不太有利地使用人ACE2作为进入受体。冷冻电子显微镜分析揭示了一个涉及蛋白质-聚糖相互作用的RBD-ACE2结合界面，不同于其他已知使用ACE2的冠状病毒。我们确定了人ACE2的残基337-342是限制NeoCoV进入的分子决定因素，而含有T510F RBD突变的NeoCoV S假型病毒能有效进入表达人ACE2的细胞。尽管多克隆SARS-CoV-2抗体或MERS-CoV RBD特异性纳米抗体不能交叉中和NeoCoV或PDF-2180，但一种ACE2特异性抗体和两种广泛中和的β冠状病毒抗体能有效抑制这两种假型病毒。我们描述了使用ACE2作为进入受体的MERS-CoV相关病毒，强调了受体使用的混杂性和潜在的人畜共患威胁。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 蝙蝠中MERS-CoV近亲NeoCoV和PDF-2180使用何种受体进入细胞？
- 核心机制
- NeoCoV和PDF-2180通过其刺突蛋白RBD与蝙蝠ACE2结合，并利用ACE2作为进入受体，其结合界面涉及蛋白质-聚糖相互作用，与已知ACE2使用冠状病毒不同。
- 主要证据
- 假型病毒进入实验显示NeoCoV和PDF-2180可有效进入表达蝙蝠ACE2的细胞；冷冻电镜解析了RBD-ACE2复合物结构；突变分析验证了关键残基和聚糖相互作用。
- 研究意义
- 揭示了MERS-CoV相关病毒使用ACE2作为受体，强调了受体使用的混杂性和潜在的人畜共患威胁，为监测和应对未来疫情提供了重要信息。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
RBD结合验证
验证病毒RBD是否介导与ACE2受体的特异性结合。
使用RBD–hFc融合蛋白进行活细胞结合实验、流式细胞术、生物层干涉测量法和ELISA，检测RBD与不同ACE2直系同源物的结合能力，并通过竞争中和实验验证。
结构与突变分析
确定RBD与ACE2结合的分子机制并验证关键界面残基。
通过冷冻电镜解析NeoCoV RBD–Bat37ACE2和PDF-2180 RBD–Bat37ACE2复合物的结构，并通过定点突变和功能实验验证关键残基和聚糖相互作用的重要性。
宿主范围决定因素
识别限制或促进NeoCoV和PDF-2180使用人ACE2的分子决定因素。
比较hACE2和Bat37ACE2序列和结构，构建hACE2交换突变体，并通过假型病毒进入实验和RBD结合实验评估其功能。同时预测并验证RBM突变对hACE2结合的影响。
抗原性与中和评估
评估现有抗体对NeoCoV和PDF-2180的中和活性。
检测SARS-CoV-2疫苗血清、MERS-CoV RBD纳米抗体以及广泛中和抗体B6和S2P6对假型病毒的中和效果。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 假型病毒生产 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Life Technologies | -- |
| 蛋白质表达与纯化 | GeneTwin转染试剂 | Biomed | TG101-01 |
| 蛋白质纯化 | Pierce Protein A/G Plus琼脂糖 | Thermo Scientific | 20424 |
| Strep-Tactin XT 4Flow高容量树脂 | IBA | 2-5030-002 | |
| 蛋白质浓度测定 | Omni-Easy即时BCA蛋白定量试剂盒 | Epizyme | ZJ102 |
| 冷冻电镜样品制备 | Cflat R1.2/1.3 300目网格 | -- | -- |
| 2/2 C-flat网格 | Protochips | -- | |
| 冷冻电镜数据采集 | Titan Krios显微镜 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| K2探测器 | Gatan | -- | |
| K2 Summit直接探测器 | Gatan | -- | |
| 免疫荧光 | Alexa Fluor 594偶联山羊抗小鼠IgG | Thermo Fisher Scientific | A32742 |
| 假型病毒进入实验 | Bright-Glo荧光素酶检测试剂盒 | Promega | E2620 |
| SpectraMax iD3多功能微孔板发光检测仪 | Molecular Devices | -- | |
| GloMax 20/20发光检测仪 | Promega | -- | |
| Western blot | 抗Flag抗体 | Sigma-Aldrich | F1804 |
| 抗HA抗体 | BioLegend | 901515 | |
| 抗VSV-M抗体 | Kerafast | EB0011 | |
| 抗GAPDH抗体 | AntGene | ANT325 | |
| BLI结合实验 | Octet RED96仪器 | Molecular Devices | -- |
| 蛋白A生物传感器 | ForteBio | 18-5010 | |
| ELISA | HRP偶联山羊抗人Fc抗体 | Sigma-Aldrich | T8802 |
| 底物溶液 | Solarbio | PR1210 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Monad | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| OPM-293 CD03无血清培养基 | OPM Biosciences | -- | |
| SMM 293-TII表达培养基 | Sino Biological | M293TII | |
| FreeStyle 293表达培养基 | Life Technologies | -- | |
| 含Earle's平衡盐溶液的最低必需培养基 | Gibco | -- | |
| 稳定细胞系构建 | Lip2000转染试剂 | Biosharp | BL623B |
| 聚凝胺 | -- | -- | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| 蛋白质表达与纯化 | 聚乙烯亚胺MAX | Polysciences | -- |
| 293-free转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 蛋白质纯化 | Superdex 75 10/300 Increase色谱柱 | GE Healthcare | -- |
| Superdex 200 10/300 Increase色谱柱 | GE Healthcare | -- | |
| His trap HP色谱柱 | Cytiva | -- | |
| 冷冻电镜 | Solarus 950等离子清洗机 | Gatan | -- |
| Vitrobot Mark IV | FEI | -- | |
| SerialEM | -- | -- | |
| Leginon | -- | -- | |
| Gatan Quantum GIF能量过滤器 | Gatan | -- | |
| 冷冻电镜数据处理 | MotionCor2 | -- | -- |
| Gctf | -- | -- | |
| Relion | -- | -- | |
| ResMap | -- | -- | |
| Warp | -- | -- | |
| cryoSPARC | -- | -- | |
| 模型构建 | Coot | -- | -- |
| Phenix | -- | -- | |
| Rosetta | -- | -- | |
| UCSF Chimera | -- | -- | |
| UCSF ChimeraX | -- | -- | |
| 模型验证 | MolProbity | -- | -- |
| Privateer | -- | -- | |
| 假型病毒生产 | TPCK处理的胰蛋白酶 | Sigma-Aldrich | T8802 |
| 大豆胰蛋白酶抑制剂 | Sigma-Aldrich | T6414 | |
| 假型病毒滴度测定 | HiScript II Q RT SuperMix | Vazyme | R223-01 |
| 假型病毒纯化 | Amicon 30 kDa截留膜 | Merck Millipore | -- |
| 中和实验 | One-Glo-EX底物 | Promega | -- |
| Biotek Neo2酶标仪 | Agilent Technologies | -- | |
| Western blot | AffiniPure山羊抗小鼠IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-035-003 |
| AffiniPure山羊抗兔IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-035-003 | |
| Alexa Fluor 680偶联山羊抗人二抗 | Jackson ImmunoResearch | 109-625-098 | |
| Omni-ECL Femto Light化学发光试剂盒 | EpiZyme | SQ201 | |
| ChemiDoc MP成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| RBD结合实验 | Alexa Fluor 488偶联山羊抗人IgG | Thermo Fisher Scientific | A11013 |
| 流式细胞术 | CytoFLEX流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- |
| 细胞间融合实验 | EnduRen活细胞底物 | Promega | E6481 |
| Varioskan LUX多功能微孔板发光检测仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 假型病毒进入实验 | 细胞类型（HEK293T、BHK-21等）、受体表达（ACE2或DPP4直系同源物）、假型病毒剂量、感染时间和检测方法 阅读提示：Methods: Pseudotyped virus entry assay |
| RBD结合实验 | RBD–hFc蛋白浓度、ACE2直系同源物、检测方法（活细胞结合、流式、BLI、ELISA） 阅读提示：Methods: Coronavirus RBD–hFc live-cell binding assays, BLI binding assays, ELISA |
| 冷冻电镜结构解析 | 蛋白复合物组成、浓度、网格类型、数据采集参数 阅读提示：Methods: Cryo-EM sample preparation and data collection |
| 突变分析 | 突变位点、表达载体、转染条件、功能实验类型 阅读提示：Methods: Plasmids, Cell lines, Pseudotyped virus entry assay |
| 中和实验 | 抗体类型和浓度、靶细胞、假型病毒剂量、孵育时间 阅读提示：Methods: Pseudotyped virus neutralization assays |