全基因组CRISPR筛选及验证
鉴定调控铁死亡的新基因，特别是远端胆固醇生物合成途径中的基因。
在HEK293T-Cas9细胞中引入全基因组sgRNA文库，用RSL3或DMSO处理8天，通过sgRNA富集/耗竭分析鉴定铁死亡调控基因。进一步构建CYP51A1、MSMO1、EBP、SC5D、DHCR7敲除细胞系，验证其对RSL3和ML210诱导铁死亡的影响。
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7-脱氢胆固醇决定铁死亡敏感性
7-Dehydrocholesterol dictates ferroptosis sensitivity
实验完整度
高包含基因组规模CRISPR筛选、细胞功能实验（敲除/回补）、脂质过氧化检测、体外FENIX实验、肿瘤异种移植模型和肾IRI动物模型等多个独立证据层级，并进行了机制验证。
主要模型
HEK293T细胞 人癌细胞系（如SU-DHL-8、B16F10） 小鼠异种移植瘤模型 小鼠肾缺血再灌注损伤模型
重点核对
HEK293T细胞中DHCR7、SC5D等基因敲除对铁死亡敏感性的影响（图1d-h） 7-DHC处理（25 μM，24小时）对RSL3诱导铁死亡的抑制效果（图2e） DHCR7抑制剂AY9944（100 nM）和cariprazine（100 nM）处理对铁死亡的影响（扩展数据图4c, h） TASIN-30（10 μM）对EBP的抑制及对癌细胞铁死亡敏感性和7-DHC水平的影响（图4a, b） 小鼠肾IRI模型中AY9944（25 mg/kg）预处理对7-DHC水平、肾功能和组织损伤的影响（图5b-d）
摘要
铁死亡是一种由铁依赖性磷脂过氧化驱动的调节性细胞死亡形式，与多种疾病有关，包括癌症、退行性疾病和器官缺血再灌注损伤。在这里，通过使用全基因组CRISPR-Cas9筛选，我们确定了远端胆固醇生物合成中的酶通过决定7-脱氢胆固醇的水平在调节铁死亡中发挥关键但相反的作用。7-脱氢胆固醇是远端胆固醇生物合成的中间代谢物，由甾醇C5-脱饱和酶合成，并被7-脱氢胆固醇还原酶代谢用于胆固醇合成。我们发现包括MSMO1、CYP51A1、EBP和SC5D在内的通路组分是铁死亡的潜在抑制因子，而DHCR7则作为促铁死亡基因发挥作用。机制上，7-脱氢胆固醇通过利用其共轭二烯发挥抗磷脂自氧化功能，并保护质膜和线粒体膜免受磷脂自氧化，从而决定铁死亡的监测。重要的是，通过药理学靶向EBP阻断内源性7-脱氢胆固醇的生物合成可诱导铁死亡并抑制肿瘤生长，而通过抑制DHCR7增加7-脱氢胆固醇水平可有效促进癌症转移并减轻肾缺血再灌注损伤的进展，支持了这一轴在体内的关键功能。总之，我们的数据揭示了7-脱氢胆固醇作为天然抗铁死亡代谢物的意外作用，并提示药理学操纵7-脱氢胆固醇水平是治疗癌症和缺血再灌注损伤的有前景的策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 远端胆固醇生物合成途径中的基因如何调控铁死亡，以及7-脱氢胆固醇在其中的作用机制是什么？
- 核心机制
- 7-DHC通过其B环中的共轭5,7-二烯结构作为氢原子供体，抑制磷脂自氧化，保护质膜和线粒体膜免受脂质过氧化损伤，从而抑制铁死亡。
- 主要证据
- 全基因组CRISPR筛选鉴定出远端胆固醇生物合成基因MSMO1、CYP51A1、EBP和SC5D为铁死亡抑制因子，DHCR7为促铁死亡基因；敲除SC5D或补充7-DHC增加RSL3诱导的铁死亡敏感性，而敲除DHCR7或使用DHCR7抑制剂（AY9944、cariprazine）增加7-DHC水平，抑制铁死亡。体外FENIX实验证明7-DHC具有抗磷脂自氧化活性。
- 研究意义
- 该研究揭示了7-DHC作为天然抗铁死亡代谢物的新功能，并提示药理学操纵7-DHC水平（如抑制EBP或DHCR7）是治疗癌症和缺血再灌注损伤的潜在策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证7-DHC水平变化与铁死亡敏感性的关系
确认7-DHC水平决定远端胆固醇生物合成基因对铁死亡的差异性调控。
检测WT及各基因敲除细胞中7-DHC水平；在DHCR7敲除细胞中敲除SC5D以降低7-DHC，或在SC5D敲除细胞中敲除DHCR7以增加7-DHC，评估对RSL3诱导铁死亡的影响。
外源补充或药理学升高7-DHC对铁死亡的影响
验证7-DHC作为铁死亡抑制因子的普适性。
通过直接补充或MβCD包裹的7-DHC处理细胞，或使用DHCR7抑制剂AY9944、cariprazine升高内源7-DHC，检测对多种诱导剂（RSL3、ML210、Erastin）诱导铁死亡的影响。
评估7-DHC对磷脂过氧化和线粒体脂质过氧化的影响
探究7-DHC抑制铁死亡的机制是否通过抑制磷脂过氧化。
使用BODIPY 581/591 C11探针检测总脂质过氧化，MitoPeDPP探针检测线粒体脂质过氧化；比较WT和DHCR7、SC5D敲除细胞以及7-DHC处理细胞中的过氧化水平。
体外FENIX实验验证7-DHC的抗自氧化活性
明确7-DHC是否通过其共轭二烯结构发挥自由基捕获抗氧化活性。
使用FENIX实验检测7-DHC及其他甾醇（如羊毛甾醇、T-MAS、酵母甾醇、胆甾烷醇等）对EggPC脂质体自氧化的抑制能力，并比较7-DHC类似物（如麦角甾醇、豆甾醇）的活性。
体内验证抑制7-DHC生物合成对肿瘤生长的影响
评估药理学阻断7-DHC合成（TASIN-30抑制EBP）能否诱导铁死亡并抑制肿瘤生长。
在SU-DHL-8异种移植瘤模型中，腹腔注射TASIN-30（40 mg/kg）或联合Liproxstatin-1（10 mg/kg），监测肿瘤体积和重量，并通过4-HNE染色评估肿瘤组织铁死亡水平。
体内验证升高7-DHC对肾缺血再灌注损伤的保护作用
评估DHCR7抑制剂AY9944或cariprazine预处理是否通过升高7-DHC减轻肾IRI。
在C57BL/6小鼠中建立肾IRI模型，术前腹腔注射AY9944（25 mg/kg）或cariprazine（5或25 mg/kg）每日一次共四次，检测肾功能（BUN、SCr）、肾组织7-DHC水平、组织病理（PAS染色）和4-HNE水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
全基因组筛选与分析
细胞活力检测
脂质过氧化检测
脂质自氧化抑制活性检测
代谢物检测
蛋白表达检测
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| CRISPR筛选 | 人类全基因组慢病毒sgRNA文库 | Addgene | 1000000095 |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Multicell | -- |
| RPMI1640培养基 | Multicell | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 药物处理 | RSL3 | Selleck | S8155 |
| ML210 | MCE | S0788 | |
| Erastin | Sigma | E7781 | |
| Brequinar | MCE | HY-108325 | |
| Ferrostatin-1 | Selleck | S7243 | |
| Liproxstatin-1 | Selleck | S7699 | |
| AY9944 | APExBIO | A8658 | |
| 卡利拉嗪 | MCE | HY-14763 | |
| Z-VAD-FMK | Selleck | S7023 | |
| Nec-1s | Selleck | S8641 | |
| 代谢物处理 | 7-脱氢胆固醇 | Avanti | 700066 |
| 羊毛甾醇 | Avanti | 700063 | |
| T-MAS | Avanti | 700073 | |
| 胆甾烷醇 | Avanti | 700069 | |
| 酵母甾醇 | Avanti | 700118 | |
| 胆固醇 | Sangon | C3045 | |
| 麦角甾醇 | MCE | HY-N0181 | |
| 豆甾醇 | MCE | HY-N0131 | |
| 脂质过氧化检测 | BODIPY 581/591 C11探针 | Invitrogen | D3861 |
| 线粒体脂质过氧化检测 | MitoPeDPP探针 | Dojindo | M466 |
| 细胞活性检测 | CellTiter-Glo试剂盒 | Promega | G7573 |
| 脂质自氧化抑制活性检测 | STY-BODIPY探针 | Cayman Chemicals | 27089 |
| DTUN引发剂 | Cayman Chemicals | 32742 | |
| 甲基-β-环糊精 | MCE | HY-101461 | |
| Western blot | 抗GPX4抗体 | Abcam | 125066 |
| 抗ACSL4抗体 | Proteintech | 22401-1-AP | |
| 抗FSP1抗体 | Santa Cruz | sc-377120 | |
| 抗DHODH抗体 | Santa Cruz | sc-166348 | |
| 抗SLC7A11抗体 | Cell Signaling Technology | 12691 | |
| 抗DHCR7抗体 | Invitrogen | PA5-48204 | |
| 抗CYP51A1抗体 | Proteintech | 13431-1-AP | |
| 抗Flag抗体 | Proteintech | 20543-1-AP | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 10494-1-AP | |
| 抗Pan-cadherin抗体 | Diagbio | db4569 | |
| 抗LAMP2抗体 | Proteintech | 27823-1-AP | |
| 抗HA抗体 | Proteintech | 51064-2-AP | |
| 抗TOMM20抗体 | Diagbio | db50 | |
| 抗Tubulin抗体 | Diagbio | db3285 | |
| 抗PDI抗体 | Proteintech | 11245-1-AP | |
| 抗ACTIN抗体 | Diagbio | db1959 | |
| 抗CoxIV抗体 | Cell Signaling Technology | 4850T | |
| 抗PEX19抗体 | Proteintech | 14713-1-AP | |
| 抗CD71抗体 | Cell Signaling Technology | 13113S | |
| 抗H3抗体 | Cell Signaling Technology | 9715 | |
| 抗SREBP2抗体 | Proteintech | 28212-1-AP | |
| 抗转铁蛋白抗体 | Proteintech | 17435-1-AP | |
| 抗SCD1抗体 | Proteintech | 28678-1-AP | |
| 抗ACSL1抗体 | Proteintech | 13989-1-AP | |
| 质谱分析 | 7-DHC标准品 | Acmec | D96421 |
| 胆固醇标准品 | Aladin | C104029 | |
| 角鲨烯标准品 | Selleck | S4862 | |
| DHCEO标准品 | Kerafast | EVU139 | |
| 辅酶Q10标准品 | Sigma | C9538 | |
| 代谢物测量 | 丁基羟基甲苯 | Sigma Aldrich | B1378 |
| GSH检测 | 谷胱甘肽检测试剂盒 | Beyotime | S0053 |
| Fe2+检测 | FerroOrange探针 | Dojindo | F374 |
| RNA提取与qRT-PCR | TRIzol试剂 | Vazyme | R401-01 |
| qRT-PCR | HiScript III逆转录预混液 | Vazyme | R323-01 |
| ChamQ通用SYBR qPCR预混液 | Vazyme | Q711-02 | |
| 线粒体分离 | 线粒体分离试剂盒 | Sigma | ER0100 |
| 蛋白质定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Yeasen Biotechnology | 20201ES76 |
| 质膜分离 | OrgFrontier™质膜分离试剂盒 | BioVision | K414-10 |
| 动物实验 | 基质胶 | CORNING | 356231 |
| 尿素检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | C013-2-1 | |
| 肌酐检测试剂盒 | Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute | C011-2-1 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 基因敲除细胞系构建 | 细胞系（HEK293T等）、基因（CYP51A1、MSMO1、EBP、SC5D、DHCR7）、sgRNA序列、转染方法、筛选方法（嘌呤霉素浓度） 阅读提示：Methods: Generation of CRISPR–Cas9 genome-edited cell lines |
| 细胞活力检测 | 细胞密度（3000-20000 cells/well）、药物浓度（RSL3、ML210等）、处理时间（6-24小时）、血清条件（FBS或LPDS） 阅读提示：Methods: CellTiter-Glo assay |
| 脂质过氧化检测 | 细胞密度、BODIPY C11浓度（5 μM）、MitoPeDPP浓度（0.5 μM）、染色时间（30分钟）、RSL3浓度和处理时间（如2.5 μM 1-2小时） 阅读提示：Methods: Lipid peroxidation and mitochondrial lipid peroxidation measurement |
| 体外FENIX实验 | EggPC浓度（1 mM）、STY-BODIPY浓度（1 μM）、DTUN量（6 μL，10 mM）、甾醇浓度（7-DHC等） 阅读提示：Methods: FENIX assay |
| 代谢物测量 | 细胞数量（2×10^6-1×10^8）、提取溶剂、LC-MS/MS参数（SRM transitions）、标准品 阅读提示：Methods: Metabolites measurement by mass spectrometry |
| 动物实验 | 动物品系和性别（C57BL/6雄性或裸鼠）、年龄、细胞注射数量（如B16F10 3×10^5，SU-DHL-8 4×10^6）、给药剂量（TASIN-30 40 mg/kg，AY9944 25 mg/kg）、给药频率和时间 阅读提示：Methods: Animal studies |
| 肾缺血再灌注模型 | 小鼠品系和年龄（8周龄C57BL/6）、手术方法（夹闭时间30分钟）、给药方案（AY9944或cariprazine剂量和次数）、检测时间点（再灌注后24小时） 阅读提示：Methods: Induction of kidney ischemia-reperfusion injury |