鉴定耐药相关的CDK6-INK4复合物
确定CDK4/6i耐药细胞中CDK6的相互作用蛋白，寻找介导耐药的分子复合物。
对CDK4/6i敏感和耐药细胞（MCF7亲本和FAT1缺失细胞）进行免疫沉淀和质谱分析，发现INK4蛋白p15和p18与CDK6特异性结合；通过共免疫沉淀和免疫印迹验证；并通过PRISM细胞系筛选关联CDK4/6i耐药性。
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INK4肿瘤抑制蛋白介导对CDK4/6激酶抑制剂的耐药性
INK4 Tumor Suppressor Proteins Mediate Resistance to CDK4/6 Kinase Inhibitors
实验完整度
高包含细胞系模型、体外激酶实验、结构模拟、PDX模型和体内异种移植实验，并进行了遗传敲除/敲低验证和降解剂功能验证。
主要模型
MCF7细胞系（亲本及CDK6高表达、FAT1缺失变体） ER+乳腺癌细胞系（T47D、CAMA1、ZR-75-1、EFM19） 患者来源异种移植模型（PDX） 细胞系来源异种移植模型（CDX）
重点核对
CDK6与INK4蛋白（p15、p18）的相互作用及复合物形成 INK4结合位点突变（V16D、R31C）对CDK4/6i敏感性的影响 p18INK4C对CDK6-cyclin D3激酶活性及CDK4/6i抑制效果的影响 降解剂BSJ-05-017和BSJ-03-096对CDK4/6的降解效力及抗肿瘤效果
摘要
细胞周期蛋白依赖性激酶4和6（CDK4/6）是乳腺癌的主要治疗靶点。这些激酶通过ATP竞争性抑制剂（CDK4/6i）在临床上被靶向；然而，耐药性通常随时间出现。为了理解CDK4/6i耐药性，我们调查了超过1300例乳腺癌，并确定了多个遗传改变（如FAT1、PTEN或ARID1A缺失）汇聚于CDK6的上调。在机制上，我们证明CDK6通过诱导并结合CDK抑制剂INK4蛋白（如p18INK4C）导致耐药性。体外结合和激酶实验以及物理建模揭示，p18INK4C–cyclin D–CDK6复合物阻碍CDK4/6i结合，而仅弱抑制ATP结合。抑制INK4表达或其与CDK6的结合可恢复CDK4/6i敏感性。为克服这一限制，我们开发了将帕博西尼与E3配体偶联的双功能降解剂。两个先导化合物强烈降解CDK4/6，在体内产生显著抗肿瘤效果，表明尽管存在CDK4/6i耐药性，重新靶向CDK4/6具有有前景的治疗潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CDK4/6抑制剂耐药性的分子机制是什么？如何克服这种耐药性？
- 核心机制
- CDK6上调诱导INK4蛋白（如p18INK4C）表达并与CDK6结合，形成p18–cyclin D–CDK6复合物，该复合物阻碍CDK4/6抑制剂结合但仅弱抑制ATP结合，从而维持激酶活性并导致耐药，同时INK4蛋白本身也上调。
- 主要证据
- 通过在CDK4/6i敏感和耐药细胞系中的免疫沉淀和质谱分析鉴定CDK6–INK4复合物；体外激酶实验显示p18降低CDK4/6i抑制效力；结构模拟显示INK4结合减少CDK4/6i结合口袋体积；CDK6–INK4界面突变恢复药物敏感性；CDK4/6降解剂在体内诱导CDK4/6降解并抑制肿瘤生长。
- 研究意义
- 本研究揭示CDK6–INK4复合物是CDK4/6i耐药的关键机制，并开发了有效的CDK4/6降解剂，为克服耐药性提供了新策略，可能适用于CDK6高表达的多种癌症。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证CDK6-INK4相互作用在耐药中的功能
确定CDK6与INK4结合是否介导CDK4/6i耐药。
通过点突变破坏CDK6-INK4界面（V16D、R31C），观察对RB磷酸化、细胞活力和细胞周期的影响；敲除CDKN2B和CDKN2C恢复药物敏感性；过表达p16降低药物效力。
体外重建并分析CDK6-INK4复合物的耐药机制
在体外验证CDK6-INK4复合物对CDK4/6i的敏感性，并阐明结构基础。
使用重组CDK6-cyclin D3和p18INK4C进行体外激酶实验，测定药物抑制效果；使用分子模拟和MST分析药物结合亲和力变化；结构模拟显示INK4结合改变CDK6构象。
评估患者和临床样本中CDK6高表达的频率
确定CDK6高表达及相关遗传改变在患者中的流行程度。
通过IHC检测PDX模型中CDK6、INK4、FAT1、YAP表达；分析MSK-IMPACT测序数据，统计HR+/HER2-乳腺癌患者中CDK6相关遗传改变的发生率；通过PTEN或ARID1A敲低验证CDK6上调机制。
开发双功能降解剂靶向CDK4/6
开发能降解CDK4/6的PROTAC化合物，克服CDK6-INK4复合物造成的耐药。
合成了帕博西尼与CRBN或VHL配体连接的双功能降解剂；筛选出BSJ-05-017和BSJ-03-096；在体外和体内评估降解效力及抗肿瘤活性。
评估降解剂的体内抗肿瘤效果
验证CDK4/6降解剂在CDK4/6i耐药模型中的治疗效果。
在CDK6高表达的异种移植瘤中评估BSJ-05-017和BSJ-03-096对肿瘤生长的影响，并检测CDK4/6降解和下游信号抑制。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | 阿贝西利 | Selleck Chemicals | LY2835219 |
| 帕博西尼 | Selleck Chemicals | PD-0332991 | |
| 瑞博西尼 | Novartis | LEE011 | |
| 免疫印迹 | 磷酸化RB1 (Ser780)抗体 | Cell Signaling Technology | 8180 |
| 磷酸化RB1 (Ser807/811)抗体 | Cell Signaling Technology | 8516 | |
| RB1抗体 | Cell Signaling Technology | 9309 | |
| 细胞周期蛋白D1抗体 | Cell Signaling Technology | 2978 | |
| CDK6抗体 | Cell Signaling Technology | 3136 | |
| CDK4抗体 | Cell Signaling Technology | 12790 | |
| CDK2抗体 | Cell Signaling Technology | 2546 | |
| E2F1抗体 | Cell Signaling Technology | 3742 | |
| 细胞周期蛋白A2抗体 | Cell Signaling Technology | 4656 | |
| 细胞周期蛋白E2抗体 | Cell Signaling Technology | 4132 | |
| YAP抗体 | Cell Signaling Technology | 14074 | |
| TAZ抗体 | Cell Signaling Technology | 4883 | |
| p18抗体 | Cell Signaling Technology | 2896 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 4970 | |
| FAT1抗体 | Abcam | ab190242 | |
| p15INK4B抗体 | Abcam | ab53034 | |
| 激酶实验 | 重组人CDK6-cyclin D3 | SignalChem | C35-10H |
| 重组人CDK4-cyclin D3 | SignalChem | C31-18G | |
| RB1蛋白 | Abcam | ab56270 | |
| ADP-Glo激酶检测试剂盒 | Promega | V6930 | |
| 免疫沉淀 | CDK4抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-23896 |
| CDK6抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-177-G | |
| 免疫印迹 | 激酶裂解缓冲液 | Cell Signaling Technology | 9803 |
| 激酶实验 | 激酶反应缓冲液 | SignalChem | K03-09 |
| 免疫沉淀 | Pierce免疫共沉淀裂解缓冲液 | Pierce | 87787 |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 | Pierce | 78444 | |
| 染色质免疫沉淀级磁珠 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 质谱分析 | Q Exactive Plus质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 克隆与质粒 | LentiCRISPRv2载体 | Addgene | 98290 |
| lentiCRISPRv2 hygro载体 | Addgene | 98291 | |
| lenti-sgRNA neo载体 | Addgene | 104992 | |
| pLKO-PTEN-shRNA-1320 | Addgene | 25638 | |
| pLKO-PTEN-shRNA-3001 | Addgene | 25639 | |
| pDONR223-CDK6 | Addgene | -- | |
| MSCV-N-Flag-HA-IRES-PURO | Addgene | 23688 | |
| pLenti PGK Neo DEST | Addgene | 19067 | |
| QuikChange II XL定点突变试剂盒 | Agilent Technologies | 200522 | |
| 病毒转染 | X-tremeGENE HP转染试剂 | Roche | -- |
| 聚凝胺 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 细胞筛选 | 嘌呤霉素 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| G418 | InvivoGen | -- | |
| 潮霉素 | InvivoGen | -- | |
| 细胞活力测定 | 刃天青 | R&D Systems | -- |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Fisher Scientific | -- |
| 免疫印迹 | Intercept (TBS)封闭缓冲液 | LI-COR Bioscience | 927-60001 |
| Odyssey Clx成像系统 | LI-COR Bioscience | -- | |
| 免疫组织化学 | FAT1抗体 | Abcam | ab190242 |
| YAP抗体 | Cell Signaling Technology | 14074 | |
| CDK6抗体 | Sigma-Aldrich | HPA002637 | |
| p15抗体 | R&D Systems | MAB6798 | |
| p18抗体 | Cell Signaling Technology | 2896 | |
| Leica DMi8显微镜 | Leica | -- | |
| MST分析 | 蛋白标记试剂盒 RED-NHS | NanoTemper Technologies | -- |
| Monolith NT.115 | NanoTemper Technologies | -- | |
| MO.Affinity Analysis软件 | NanoTemper Technologies | -- | |
| 流式细胞术 | CellEvent衰老绿色流式细胞术检测试剂盒 | Invitrogen | -- |
| 碘化丙啶 | Invitrogen | -- | |
| RNase A | Invitrogen | -- | |
| BD Biosciences LSR Fortessa流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| FCS Express 7软件 | De Novo Software | -- | |
| 测序分析 | MSK-IMPACT | FDA授权 | -- |
| 动物实验 | 雌二醇缓释片 | -- | 25 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞系来源 | 细胞系名称、培养基、补充成分（如FBS浓度、抗生素）、培养条件、传代数、支原体检测 阅读提示：Methods: Cell Lines |
| 药物处理 | 药物名称、浓度、溶剂（DMSO）、处理时间、对照（如DMSO） 阅读提示：Methods: Drugs and Reagents; Figure Legends |
| 激酶活性测定 | 免疫沉淀抗体、激酶反应缓冲液组成、ATP浓度、底物（RB1）、孵育温度和时间、ADP-Glo检测步骤 阅读提示：Methods: IP–In Vitro Kinase Assay |
| 体外激酶实验 | 重组激酶浓度、p18浓度、药物浓度、预孵育时间、ATP浓度、RB1浓度、反应时间 阅读提示：Methods: In Vitro Kinase Assay Using Recombinant Proteins |
| 细胞活力测定 | 细胞接种密度、药物处理时长、Resazurin浓度、荧光读数时间、IC50计算模型 阅读提示：Methods: Cell Viability Assay |
| 免疫印迹 | 裂解缓冲液、蛋白上样量、凝胶浓度、转膜条件、封闭液、一抗和二抗浓度、曝光条件 阅读提示：Methods: Western Blotting |
| 免疫组织化学 | 组织固定和切片、抗原修复、抗体浓度、检测系统（DAB）、评分方法 阅读提示：Methods: IHC |
| 基因编辑 | sgRNA序列、载体、转染/感染方法、筛选药物和浓度、敲除/敲低效率验证 阅读提示：Methods: Cloning and Plasmids; Lentiviral and Retroviral Infection |
| 体内实验 | 小鼠品系、性别、年龄、肿瘤细胞注射数量、雌激素缓释片植入、给药路径和剂量、给药周期、肿瘤测量频率、终点标准 阅读提示：Methods: Pharmacodynamic Study; Efficacy Study |