鉴定HBV感染下的UBXN7蛋白变化
分析HBV感染对宿主蛋白泛素化及UBXN7表达的影响。
利用SILAC和蛋白质组学分析比较HepG2.2.15和HepG2细胞，通过Western blot和RT-qPCR验证UBXN7蛋白和mRNA水平。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
HBV X蛋白通过诱导NF-κB信号的新型负调控因子UBXN7降解来促进HBV复制
HBV X Protein Induces Degradation of UBXN7, a Novel Negative Regulator of NF-κB Signaling, to Promote HBV Replication
实验完整度
高包含SILAC蛋白质组学、体外细胞实验、体内小鼠实验、功能验证和机制验证，多层级证据。
主要模型
HepG2.2.15细胞 HepAD38细胞 原代人肝细胞 BALB/c小鼠 Huh7细胞 HepG2细胞
重点核对
HBV感染通过蛋白降解降低UBXN7蛋白水平，mRNA水平不变 HBx与UBXN7相互作用并促进其K48连接泛素化降解 UBXN7通过UAS结构域与IKK-β相互作用，促进其降解 UBXN7通过抑制NF-κB信号和自噬来抑制HBV复制 体内实验中UBXN7过表达抑制HBV复制
摘要
慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染是肝细胞癌的主要原因。然而，HBV对宿主蛋白泛素化的影响及其机制仍不完全清楚。本研究旨在探讨HBV是否以及如何通过影响宿主蛋白泛素化来促进自身复制。本研究发现，UBXN7是核因子κB（NF-κB）信号的新型抑制因子，通过与HBV X蛋白（HBx）相互作用而被降解，从而激活NF-κB信号和自噬，进而影响HBV复制。通过Western blot和定量逆转录聚合酶链反应分析了HBV转染的肝癌细胞和HBV感染的原代人肝细胞（PHHs）中UBXN7的表达。利用体外和体内实验，包括稳定同位素标记氨基酸细胞培养（SILAC）分析，分析了UBXN7对HBV复制的影响。在肝癌细胞系中分析了HBV复制的变化及相关分子机制。SILAC分析显示，与对照细胞相比，HepG2.2.15细胞中UBXN7的泛素化显著增加。HBV感染后，HBx蛋白与UBXN7相互作用，促进UBXN7在K99位点的K48连接的泛素化，导致UBXN7降解。另一方面，UBXN7通过其泛素相关结构域与IκB激酶β的ULK结构域相互作用，促进其降解。这反过来减少了NF-κB信号，导致自噬减少，从而降低HBV复制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- HBV如何通过泛素化修饰宿主蛋白来促进自身复制？
- 核心机制
- HBx通过与UBXN7相互作用，促进其K48连接泛素化降解，从而维持IKK-β水平，激活NF-κB信号和自噬，最终促进HBV复制。
- 主要证据
- SILAC分析、免疫共沉淀、泛素化实验、Western blot、ELISA、RT-qPCR、小鼠体内实验等显示UBXN7的降解及下游信号调控。
- 研究意义
- 研究揭示UBXN7是HBV复制的负调控因子，可能成为HBV相关疾病的潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证HBx促进UBXN7降解
确定HBV编码的哪种蛋白并验证其通过何种途径降低UBXN7蛋白水平。
转染HBV表达质粒或HBx表达质粒，并用MG132、NH4Cl、CQ处理，检测UBXN7蛋白水平；通过CHX实验测定UBXN7半衰期。
分析HBx促进UBXN7泛素化
确定HBx是否促进UBXN7的K48链泛素化及其位点。
共转染HA-Ub、FLAG-UBXN7和HBx，进行免疫沉淀和Western blot，使用野生型和突变泛素检测链接类型，并构建UBXN7突变体验证泛素化位点。
验证UBXN7抑制NF-κB信号通路
确定UBXN7是否通过影响IKK-β来调节NF-κB信号。
进行荧光素酶报告基因实验，免疫共沉淀检测UBXN7与NF-κB通路蛋白的相互作用，Western blot分析IKK-β和IκBα的表达和磷酸化。
验证UBXN7对HBV复制的影响
评估UBXN7对HBV复制的影响。
过表达或敲低UBXN7，检测HBsAg、HBeAg、HBV RNA和DNA水平。
验证UBXN7的UAS结构域功能
确定UAS结构域对UBXN7功能的重要性。
使用UAS缺失突变体，检测NF-κB信号、自噬及HBV复制指标。
体内验证UBXN7的抑制作用
验证UBXN7在体内对HBV复制的抑制效果。
通过水动力注射将pHBV1.3和UBXN7表达质粒导入小鼠，检测血清HBsAg、HBeAg和肝脏HBV RNA、HBc蛋白和IKK-β水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
蛋白表达与修饰分析
信号通路分析
病毒复制检测
自噬分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Dulbecco改良Eagle培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| G418 | -- | -- | |
| 大鼠尾I型胶原 | Corning | 354236 | |
| 药物处理 | 四环素 | Meilunbio | MB5564 |
| 氯喹 | Sigma-Aldrich | C6628 | |
| 氯化铵 | Sigma-Aldrich | A9434 | |
| MG-132 | Sigma-Aldrich | M7449 | |
| 蛋白质提取 | 蛋白酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | P1860 |
| Western blot | 抗磷酸化IKKα/β抗体 | Cell Signaling Technology | 2697 |
| 抗总IKKβ抗体 | Cell Signaling Technology | 2684 | |
| 抗磷酸化IκBα抗体 | Cell Signaling Technology | 9246S | |
| 抗总IκBα抗体 | Cell Signaling Technology | 4812S | |
| 抗LC3I/II抗体 | Cell Signaling Technology | 4108 | |
| 抗β-微管蛋白抗体 | Proteintech | 10094-1-AP | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 10494-1-AP | |
| 抗Myc标签抗体 | Proteintech | 16286-1-AP | |
| 抗Flag标签抗体 | Proteintech | 20543-1-AP | |
| 抗HA标签抗体 | Proteintech | 51064-2-AP | |
| 免疫组化/免疫荧光 | 抗HBcAg抗体 | Millipore | MAB16990 |
| Western blot | 抗UBXN7抗体 | Novus Biologicals | NBP 2-2 2223 |
| 辣根过氧化物酶标记二抗 | Sigma-Aldrich | 71045-M和12-348 | |
| 免疫共沉淀 | Flag磁珠 | Sigma-Aldrich | M8823 |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| 逆转录 | M-MLV逆转录酶试剂盒 | Invitrogen | -- |
| 实时荧光定量PCR | SYBR Select预混液 | Life Technologies | -- |
| SILAC | SILAC蛋白定量试剂盒 | -- | -- |
| Northern/Southern blot | DIG Northern起始试剂盒 | Roche Diagnostics | -- |
| 荧光素酶活性检测 | 双荧光素酶系统 | Promega | -- |
| ELISA | ELISA试剂盒 | Kehua Bio-engineering | -- |
| 细胞培养 | HEK293细胞 | -- | -- |
| Huh7细胞 | -- | -- | |
| HepG2细胞 | -- | -- | |
| HepAD38细胞 | -- | -- | |
| HepG2-NTCP细胞 | -- | -- | |
| HepG2.2.15细胞 | -- | -- | |
| 原代人肝细胞 | -- | -- | |
| 转染 | 小干扰RNA | RiboBio | stB0010599 |
| 脂质体转染试剂 | -- | -- | |
| 自噬分析 | GFP-LC3荧光标记物 | -- | -- |
| 免疫荧光 | DAPI | Promoter Biotechnology | -- |
| 自噬分析 | 共聚焦显微镜 | Leica | SP8 |
| 统计分析 | GraphPad Prism软件 | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系：HepG2.2.15、HepAD38、HepG2-NTCP、PHHs；培养基：DMEM；血清：10% FBS；添加物：G418浓度（400 μg/mL），胶原蛋白浓度（50 μg/mL）；培养条件：37°C、5% CO2。 阅读提示：Methods: Cell Culture |
| 质粒转染 | 质粒：pHBV1.3、pHBV1.2、pHBV1.2-Δx、HBx表达质粒、UBXN7表达质粒及突变体、IKK-β表达质粒；转染试剂；转染时间：48小时。 阅读提示：Methods: Plasmids and Transfection |
| UBXN7降解实验 | 抑制剂：MG132（浓度）、NH4Cl（浓度）、CQ（浓度）；处理时间；HBV质粒剂量。 阅读提示：Results: Hepatitis B X Protein Suppresses UBXN7 Protein Level via the Proteasome Pathway |
| 泛素化实验 | 质粒：HA-Ub-WT、K48、K63；UBXN7突变体（K84R、K99R）；MG132浓度；免疫沉淀抗体。 阅读提示：Results: Hepatitis B X Protein Promotes K48-Linked Ubiquitination of UBXN7 |
| NF-κB信号分析 | 细胞系：Huh7；质粒：NF-κB-Luc，UBXN7表达质粒；检测方法：荧光素酶活性、Western blot；处理：HBV质粒。 阅读提示：Results: UBXN7 Inhibits NF-κB Signaling via IKK-β |
| HBV复制检测 | 细胞系：Huh7、HepG2、HepG2.2.15；转染：pHBV1.3、UBXN7表达质粒或siRNA；检测指标：HBsAg、HBeAg、HBV RNA、HBV DNA；试剂盒：ELISA。 阅读提示：Results: UBXN7 Inhibits HBV Transcription and Replication |
| 体内实验 | 动物：BALB/c小鼠；注射质粒量：pHBV1.3 10 μg，UBXN7 20 μg；注射方式：水动力注射；时间：96小时；检测：血清HBsAg/HBeAg，肝脏HBV RNA、HBc、IKK-β。 阅读提示：Methods: Hydrodynamics-Based Transfection in Mice |
| 自噬检测 | 细胞系：HepG2.2.15、PHHs、HepG2-NTCP；质粒：GFP-LC3、UBXN7或ΔUAS；处理时间：48小时；检测：共聚焦显微镜计数LC3点，Western blot分析LC3-II。 阅读提示：Methods: Autophagosome Formation Assay |