PHH大鼠模型建立与转录组分析
建立PHH大鼠模型，通过转录组测序和生物信息学分析，识别关键炎症通路和免疫细胞类型。
通过向侧脑室注射自体动脉血建立PHH模型，48小时后取脉络丛进行RNA测序，使用CIBERSORT算法分析免疫细胞浸润，鉴定差异表达基因和富集通路。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
脉络丛CCL2-CCR2信号在脑积水中协调巨噬细胞募集和脑脊液分泌过多
Choroid plexus CCL2‒CCR2 signaling orchestrates macrophage recruitment and cerebrospinal fluid hypersecretion in hydrocephalus
实验完整度
高包含体内大鼠PHH模型、体外细胞共培养、转录组测序、免疫荧光、Western blot等多种验证，并进行了机制（TNF-α/TNFR1/NF-κB）和功能验证（CSF分泌率、脑室体积）。
主要模型
Sprague-Dawley大鼠PHH模型 大鼠原代脉络丛上皮细胞 大鼠NR8383巨噬细胞系 AAV-CCL2大鼠模型
重点核对
PHH模型的建立：200 μL非肝素化动脉血以14 μL/min注入侧脑室 Bindarit给药剂量和途径：30 mg/kg腹腔注射，每12小时一次，从IVH前12小时开始至IVH后36小时 INCB3284给药剂量和途径：1 mg/kg腹腔注射，每12小时一次，从IVH前12小时开始至IVH后36小时 CSF分泌率测量方法：使用矿物油闭塞导水管，收集40分钟CSF计算
摘要
脉络丛（ChP）是脑脊液（CSF）的主要产生部位。近年来，脉络丛炎症导致的CSF分泌过多已成为脑积水的重要发病机制。然而，脑积水中脉络丛炎症及其随后CSF分泌过多的确切机制仍不清楚。在本研究中，我们阐明了巨噬细胞在脉络丛炎症发病机制中的关键作用。具体而言，我们确定了由脉络丛上皮细胞释放的趋化因子CCL2，招募CCR2+单核细胞至脉络丛，从而引发脑积水发病。聚集的脉络丛巨噬细胞通过TNF-α/TNFR1/NF-κB信号级联增加脉络丛上皮细胞的炎症，从而导致CSF分泌过多。引人注目的是，使用腺相关病毒（AAV）方法增强脉络丛CCL2，加剧了大鼠PHH模型中的巨噬细胞招募、激活和脑室扩大。全身应用Bindarit（一种特异性CCL2抑制剂）可显著抑制脉络丛巨噬细胞浸润和激活，并降低CSF分泌率。此外，给予CCR2拮抗剂（INCB 3284）可减少脉络丛巨噬细胞积聚和脑室扩大。这项研究不仅揭示了脉络丛CCL2-CCR2信号在脑积水病理生理学中的作用，而且揭示了Bindarit作为出血后脑积水治疗的有希望的选择。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 脑积水中脉络丛炎症的起始因素及驱动CSF分泌过多的分子机制是什么？
- 核心机制
- 脉络丛上皮细胞释放CCL2招募CCR2+单核细胞至脉络丛，分化为巨噬细胞；巨噬细胞通过TNF-α/TNFR1/NF-κB信号级联促进上皮细胞炎症，上调pNKCC1，导致CSF分泌过多。
- 主要证据
- 通过转录组测序发现CCL2上调，体外共培养证明CCL2介导巨噬细胞迁移，巨噬细胞条件培养基激活NF-κB和pNKCC1；体内AAV-CCL2过表达加重巨噬细胞浸润和脑室扩大，Bindarit或INCB3284抑制CCL2/CCR2能减轻炎症和脑室扩大。
- 研究意义
- 本研究揭示的CCL2-CCR2信号通路为脑积水提供了潜在治疗靶点，并提示Bindarit可作为出血后脑积水的治疗选择。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外细胞共培养验证CCL2介导的巨噬细胞迁移
验证脉络丛上皮细胞分泌的CCL2能否募集巨噬细胞，并检测药物抑制效果。
使用Transwell共培养系统，将NR8383细胞置于上室，原代CPEC置于下室，LPS刺激后观察NR8383迁移，并用Bindarit（300 μmol/L）处理下室以抑制CCL2。
体外机制研究：巨噬细胞对CPEC的影响
探究巨噬细胞如何影响脉络丛上皮细胞，特别是TNF-α/TNFR1/NF-κB通路的作用。
使用NR8383条件培养基（NCM）或重组TNF-α处理CPEC，检测NF-κB磷酸化、炎症因子和pNKCC1表达；使用R7050（TNFR1抑制剂）、Bay117082（NF-κB抑制剂）和抗TNF-α中和抗体进行干预。
AAV-CCL2过表达体内验证
验证脉络丛CCL2过表达是否足以诱导巨噬细胞浸润和脑积水。
通过宫内脑室内注射AAV2/5-CCL2，21天后注射自体血液建立PHH，23天后MRI检测脑室体积，并分析巨噬细胞标志物和CSF分泌率。
药物抑制CCL2/CCR2信号的体内治疗实验
验证抑制CCL2或CCR2是否能减轻PHH模型中的巨噬细胞浸润和脑室扩大。
PHH模型中给予Bindarit或INCB3284，通过MRI测量脑室体积，免疫荧光和Western blot检测巨噬细胞浸润和激活，以及CSF分泌率。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 人表皮生长因子 | -- | -- | |
| 胰酶 | -- | -- | |
| LPS刺激 | 脂多糖 | Solaribio | L8880 |
| TNF-α受体抑制 | R7050 | MCE | HY-110203 |
| TNF-α中和 | 抗TNF-α抗体 | Sino Biological | 80045-RP02 |
| TNF-α处理 | 重组大鼠TNF-α | Peprotech | 400-14-5 |
| NF-κB通路抑制 | Bay117082 | MCE | HY-13453 |
| CCL2抑制 | Bindarit | MCE | HY-B0498 |
| CCR2拮抗 | INCB3284 | MCE | HY-15450A |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| RNA质检 | NanoDrop ND-1000 | NanoDrop | -- |
| Agilent 2100 | Agilent | -- | |
| 测序 | Illumina NovaSeq 6000 | Illumina | -- |
| CSF分泌率测定 | 矿物油 | Sigma-Aldrich | -- |
| CSF细胞因子检测 | 大鼠细胞因子/趋化因子芯片 | Neobioscience | -- |
| 细胞因子检测 | 炎症细胞因子检测试剂盒 | Neobioscience | -- |
| cDNA合成 | 逆转录试剂盒 | Vazyme | -- |
| MRI | Bruker BioSpec小动物7T磁共振成像仪 | Bruker | -- |
| MRI图像分析 | 3D-Slicer软件 | -- | -- |
| Western blot | CD68抗体 | Proteintech | 28058-1-AP |
| IBA-1抗体 | Proteintech | 10904-1-AP | |
| TNFR1抗体 | Proteintech | 21574-1-AP | |
| β-肌动蛋白抗体 | Abcam | ab8227 | |
| CCL2抗体 | Abcam | ab7202 | |
| p-NKCC1抗体 | Sigma | ABS1004 | |
| NKCC1抗体 | Abcam | ab303518 | |
| NF-κB抗体 | CST | 8242 | |
| pNF-κB抗体 | CST | 3033 | |
| iNOS抗体 | Abcam | ab178945 | |
| 免疫荧光 | CCR2抗体 | Abcam | ab273050 |
| Ki67抗体 | Abcam | ab15580 | |
| TNFR2抗体 | Proteintech | 19272-1-AP | |
| TNF-α抗体 | Abcam | ab307164 | |
| ZO-1抗体 | Abcam | ab221547 | |
| TTR抗体 | Abcam | ab271132 | |
| 山羊抗兔Alexa 488偶联IgG | Jackson | 111-545-003 | |
| 山羊抗小鼠Alexa 550偶联IgG | Jackson | 115-025-003 | |
| 山羊抗兔Alexa 550偶联IgG | Jackson | 111-025-003 | |
| DAPI | Abcam | ab228549 | |
| 抗荧光淬灭封片剂 | Abcam | ab104135 | |
| 免疫荧光成像 | Vectra Polaris多光谱成像和全玻片扫描系统 | PerkinElmer | -- |
| CSF收集 | Thermo Fisher离心机 | Thermo Fisher | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立 | 大鼠品系、年龄、体重；手术方法：立体定位坐标、注血量、注射速率、注射深度；对照组设置 阅读提示：参见Materials and methods中的Animals和Posthemorrhagic hydrocephalus (PHH) models部分 |
| 细胞培养 | 原代CPEC的分离培养方法；NR8383细胞系来源；培养基成分；LPS刺激浓度和时长 阅读提示：参见Materials and methods中的Cell culture and treatments部分 |
| 药物处理 | Bindarit和INCB3284的给药剂量、途径、时间点；溶解方式（DMSO/玉米油）；对照组（10% DMSO玉米油） 阅读提示：参见Materials and methods中的Drug administration部分 |
| CSF分泌率测定 | 手术操作步骤：脑室内插管深度、矿物油注入量、PE管尺寸、CSF收集时间 阅读提示：参见Materials and methods中的Quantification of the CSF secretion rate部分 |
| 分子生物学检测 | qPCR引物序列（Table S1）；Western blot抗体浓度；ELISA试剂盒操作步骤 阅读提示：参见Materials and methods中的Quantitative PCR analysis、Western blot analysis、immunofluorescence staining以及Supporting Information Table S1 |