验证乙酸盐在NSCLC组织中的丰度和摄取
检测人NSCLC组织中乙酸盐浓度和肿瘤对乙酸盐的摄取是否增加。
对14例人NSCLC组织进行代谢组学分析，测量SCFA水平；将13C或3D标记的乙酸盐注射到荷瘤小鼠中，检测肿瘤和正常肺组织中的标记乙酸盐和乙酰辅酶A含量。
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乙酸盐通过上调c-Myc重编程肿瘤代谢并促进PD-L1表达和免疫逃逸
Acetate reprogrammes tumour metabolism and promotes PD-L1 expression and immune evasion by upregulating c-Myc
实验完整度
高包含体外细胞实验、体内动物模型（原位和皮下肿瘤模型）、患者样本分析以及转录组学数据，功能验证（增殖、免疫细胞共培养）和机制验证（乙酰化、去泛素化）健全。
主要模型
人非小细胞肺癌细胞系A549、H1299 小鼠Lewis肺癌细胞系LLC 小鼠肺癌细胞系CMT167 非小细胞肺癌患者肿瘤组织样本
重点核对
MCT1在NSCLC细胞中介导乙酸盐摄取 c-Myc Lys148乙酰化修饰状态 USP10与c-Myc的相互作用 乙酸处理条件下PD-L1表达水平 CD8+ T细胞浸润和活化程度
摘要
乙酸盐是乙酰辅酶A的前体，在能量产生、脂质合成和蛋白质乙酰化中起重要作用。然而，乙酸盐是否重编程肿瘤代谢并在肿瘤免疫逃逸中发挥作用仍不清楚。在这里，我们显示乙酸盐是人类非小细胞肺癌组织中最丰富的短链脂肪酸，且肿瘤富集的乙酸盐摄取增加。乙酸盐衍生的乙酰辅酶A诱导c-Myc乙酰化，这是由代谢酶二氢硫辛酰胺S-乙酰转移酶的 moonlighting 功能介导的。乙酰化的c-Myc增加其稳定性以及随后编码程序性死亡配体1、糖酵解酶、单羧酸转运蛋白1和细胞周期加速器的基因的转录。膳食乙酸盐补充促进肿瘤生长并抑制CD8+ T细胞浸润，而破坏乙酸盐摄取抑制免疫逃逸，这增加了基于抗PD-1的疗法的疗效。这些发现强调了乙酸盐通过重编程肿瘤代谢和免疫逃逸，除了作为碳源的代谢作用外，促进肿瘤生长的关键作用，并强调了控制乙酸盐代谢以抑制肿瘤生长和改善免疫检查点阻断疗法反应的潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 乙酸盐是否以及如何重编程肿瘤代谢并促进肿瘤免疫逃逸？
- 核心机制
- 乙酸盐通过MCT1摄取，经ACSS2转化为乙酰辅酶A，诱导DLAT对c-Myc Lys148的乙酰化，进而招募USP10去泛素化稳定c-Myc，上调PD-L1及糖酵解和细胞周期相关基因表达，促进肿瘤生长和免疫逃逸。
- 主要证据
- 通过代谢组学、同位素示踪、免疫共沉淀、质谱、体外乙酰化/去泛素化实验、细胞共培养、动物模型及IHC分析证实。
- 研究意义
- 揭示乙酸盐除作为碳源外，通过c-Myc乙酰化促进肿瘤生长的非代谢功能，提出靶向乙酸盐代谢（如抑制USP10）可改善免疫检查点阻断疗法疗效。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鉴定乙酸盐转运体MCT1
确定介导肿瘤细胞乙酸盐摄取的主要转运体。
通过shRNA敲低MCT1-MCT4和SMCT1/SMCT2，检测细胞内乙酸盐和乙酰辅酶A水平；免疫组化检测90例NSCLC组织中MCT1表达，并分析其与预后的关系。
验证乙酸盐在能量应激下促进肿瘤生长
评估乙酸盐在葡萄糖缺乏或糖酵解抑制条件下对肿瘤细胞增殖的影响。
在低糖或2-DG处理条件下，对NSCLC细胞进行乙酸处理，进行集落形成实验；在裸鼠皮下移植A549细胞，通过饮用水中补充乙酸盐，并敲低GLUT1/3，观察肿瘤生长。
鉴定c-Myc乙酰化及其功能
确认乙酸盐诱导的c-Myc乙酰化是否影响其稳定性。
通过质谱鉴定c-Myc乙酰化位点Lys148；体外乙酰化实验验证DLAT对c-Myc的乙酰化活性；CRISPR-Cas9敲入c-Myc K148R/K148Q突变体，检测c-Myc蛋白半衰期和泛素化水平。
验证c-Myc乙酰化依赖性USP10结合与去泛素化
阐明c-Myc乙酰化如何增强其稳定性（是否通过招募USP10去泛素化）。
通过免疫共沉淀、GST pulldown和体外去泛素化实验验证USP10与c-Myc的相互作用及对c-Myc泛素化的影响。
验证乙酸盐对NSCLC细胞功能和T细胞活化的影响
检验乙酸盐是否通过PD-L1影响T细胞活化。
将LLC-OVA细胞与OT-1 CD8+ T细胞共培养，检测IL-2和IFN-γ表达；敲低PD-L1或表达c-Myc突变体观察影响。
评估乙酸盐对肿瘤免疫微环境的影响
确定乙酸盐在体内对肿瘤浸润免疫细胞的影响。
通过CyTOF分析CMT167肿瘤模型中的免疫细胞亚群；检测CD8+ T细胞浸润。
验证乙酸盐在体内促进肿瘤生长和免疫逃逸
评估乙酸盐对肿瘤生长、生存期和免疫逃逸的影响。
原位注射CMT167细胞，给予2-DG和乙酸补充，检测肿瘤体积、生存期、免疫细胞浸润和组织学变化。
探索靶向USP10的联合治疗
研究抑制USP10是否增强抗PD-1疗效。
使用USP10抑制剂spautin-1和抗PD-1抗体单独或联合处理荷瘤小鼠，评估肿瘤生长和免疫指标。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| Western blot | MCT1抗体 | Abcam | ab85021 |
| Western blot and IHC | c-Myc抗体 | Abcam | ab32072 |
| Immunoprecipitation | c-Myc抗体 | Abcam | ab56 |
| IHC | USP10抗体 | Abcam | ab109219 |
| Western blot | Cyclin D1抗体 | Abcam | ab134175 |
| LKB1抗体 | Abcam | ab15095 | |
| COX IV抗体 | Abcam | ab202554 | |
| 组蛋白H3抗体 | Abcam | ab1791 | |
| IHC | 小鼠LDHA抗体 | Abcam | ab52488 |
| 小鼠颗粒酶B抗体 | Abcam | ab255598 | |
| Western blot | USP10抗体 | Cell Signaling Technology | 8501 |
| Western blot and IP | DLAT抗体 | Cell Signaling Technology | 12362 |
| Western blot | β-actin抗体 | Cell Signaling Technology | 3700 |
| ACSS2抗体 | Cell Signaling Technology | 3658 | |
| Western blot and IP | 乙酰化赖氨酸抗体 | Cell Signaling Technology | 9441 |
| Western blot | 泛素抗体 | Cell Signaling Technology | 3933 |
| 泛素抗体 | Cell Signaling Technology | 3936 | |
| IP | Flag抗体 | Cell Signaling Technology | 14793 |
| IHC | Ki-67抗体 | Cell Signaling Technology | 9129 |
| Western blot | GST抗体 | Cell Signaling Technology | 2625 |
| Western blot and IHC | GLUT1抗体 | Cell Signaling Technology | 73015 |
| Western blot | 人PD-L1抗体 | Cell Signaling Technology | 13684 |
| IHC | 人CD8抗体 | Cell Signaling Technology | 85336 |
| Western blot and IHC | 小鼠PD-L1抗体 | Cell Signaling Technology | 64988 |
| IHC | 小鼠CD8抗体 | Cell Signaling Technology | 98941 |
| IP | 正常兔免疫球蛋白 | Cell Signaling Technology | 2729 |
| Western blot | 兔IgG（HRP标记） | Cell Signaling Technology | 7074 |
| 小鼠IgG（HRP标记） | Cell Signaling Technology | 7076 | |
| MCT2抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-166925 | |
| MCT4抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-376140 | |
| SMCT2抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-515141 | |
| LDHA抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-137243 | |
| IP | 正常小鼠免疫球蛋白 | Santa Cruz Biotechnology | sc-2025 |
| Western blot and IHC | 抗小鼠MCT1抗体 | Proteintech | 20139 |
| Western blot | 抗SMCT1抗体 | Proteintech | 21433 |
| 抗ACSS1抗体 | Proteintech | 17138 | |
| Western blot and IHC | GLUT3抗体 | Proteintech | 20403 |
| 兔抗c-Myc Lys148乙酰化抗体 | Signalway Biotechnology | -- | |
| IP | Anti-Flag M2琼脂糖珠 | Sigma-Aldrich | M8823 |
| competition peptide | 3×Flag肽 | Sigma-Aldrich | F4799 |
| Western blot | 小鼠抗Flag抗体 | Sigma-Aldrich | F1804 |
| 抗His抗体 | Sigma-Aldrich | SAB1305538 | |
| in vitro acetylation assay | 乙酰辅酶A | Sigma-Aldrich | A2056 |
| inhibitor | 2-DG | Sigma-Aldrich | D8375 |
| cell treatment | 乙酸盐 | Sigma-Aldrich | S8750 |
| isotope tracing | 3D-乙酸盐 | Sigma-Aldrich | 176079 |
| derivatization | 高氯酸 | Sigma-Aldrich | 244252 |
| 碳酸氢钾 | Sigma-Aldrich | 60339 | |
| solvent | 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | D2650 |
| derivatization | EDC | Sigma-Aldrich | 03449 |
| lipid extraction | 甲醇 | Sigma-Aldrich | 34860 |
| LC-MS | 甲酸 | Sigma-Aldrich | F0507 |
| T cell activation | PMA | Sigma-Aldrich | P8139 |
| 离子霉素 | Sigma-Aldrich | I3909 | |
| cell lysis | IGEPAL CA-630 | Sigma-Aldrich | I8896 |
| T cell culture | IL-2 | Sigma-Aldrich | I0523 |
| cell culture | L-谷氨酰胺 | Sigma-Aldrich | 59202C |
| T cell activation | OVA257-264肽 | Sigma-Aldrich | S7951 |
| derivatization | 吡啶 | Macklin | P816289 |
| lipid extraction | 正己烷 | Macklin | H810749 |
| proteasome inhibition | MG-132 | Selleckchem | S2619 |
| USP10 inhibitor | spautin-1 | Selleckchem | S7888 |
| isotope tracing | 乙酸钠（1,2-13C2, 99%） | Cambridge Isotope Laboratories | CLM−440-PK |
| cell culture | D-PBS | Beyotime | C0221D |
| bioluminescence imaging | d-荧光素钾盐 | Beyotime | ST196 |
| animal treatment | 抗小鼠PD-1抗体 | Bio X Cell | BE0146 |
| IgG2a同型对照 | Bio X Cell | BE0089 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养和乙酸处理 | 细胞系来源、培养基（RPMI 1640/DMEM）、低糖培养基（5 mM）、乙酸处理浓度（1 mM）、处理时间 阅读提示：Methods：Cell lines and culture conditions |
| 乙酸盐摄取和乙酰辅酶A测量 | 标记乙酸盐浓度（1 mM）、处理时间（1-2小时）、检测方法（LC-MS/MS） 阅读提示：Methods：Detection of isotope-labelled acetate；Measurement of labelled 13C-acetyl-CoA |
| 蛋白乙酰化和稳定性实验 | MG-132浓度和处理时间（8小时）、CHX浓度和追踪时间、IP抗体、乙酰化位点突变体（K148R/K148Q） 阅读提示：Methods：DNA constructs and mutagenesis；Results 对应图2图注 |
| T细胞共培养实验 | OT-1 CD8+ T细胞分离、OVA257-264肽处理（100 nM）、共培养时间（12小时）、效应细胞与靶细胞比例 阅读提示：Methods：OVA-specific CD8+ T cell isolation and co-culture experiments |
| 动物模型 | 细胞系和注射数量（A549 1×10^6、LLC 5×10^5、CMT167 3×10^6）、小鼠品系（C57BL/6J或裸鼠）、注射部位（原位或皮下）、乙酸盐补充浓度（200 mM在水中）、2-DG剂量（500 mg/kg） 阅读提示：Methods：Animal models |