单细胞悬液制备与质量控制
获取高质量的单细胞以进行后续测序分析。
取12-14周龄雄性C57BL/6J小鼠ELG，切碎后酶消化（胶原酶I、IV和DNase I）制备单细胞悬液，过滤，去除红细胞和死细胞，并进行质量评估。
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通过单细胞RNA测序分析小鼠眶外泪腺的异质性和复杂性
Analysis of the heterogeneity and complexity of murine extraorbital lacrimal gland via single-cell RNA sequencing
实验完整度
高研究包含单细胞RNA测序、免疫组化/免疫荧光验证、CellChat通讯分析等多层级证据，并进行细胞亚群鉴定及功能富集分析。
主要模型
C57BL/6J小鼠眶外泪腺组织 体外单细胞悬液 免疫组化/免疫荧光染色组织切片
重点核对
小鼠年龄为12-14周，雄性C57BL/6J，来源为南京大学南京模型动物研究所 样本采集时间为Zeitgeber Time 3:00-4:00 单细胞悬液制备使用2 mg/ml胶原酶I、2 mg/ml胶原酶IV、1 mg/ml DNase I，在37°C消化1-2小时 质量控制标准：保留基因数300-7500且线粒体基因比例<10% 样本数：6个（每只小鼠的ELG合并为1个样本）
摘要
目的：泪腺对于维持眼表健康和避免外部损伤至关重要，它通过分泌泪膜的水层来实现。然而，健康泪腺的细胞类型清单和异质性仍未得到充分研究。方法：本文采用基于10X Genomics的单细胞RNA测序技术，对C57BL/6J小鼠眶外泪腺（ELG）的细胞多样性进行了无偏分类。从43,850个高质量细胞中，我们生成了细胞异质性图谱，并使用经典标记基因定义了细胞类型。通过生物信息学分析分析了这些细胞可能的功能。此外，利用CellChat对ELG中的细胞-细胞通讯网络进行了初步分析。结果：鉴定出超过37种细胞亚类，包括七种腺上皮细胞、三种成纤维细胞、十种髓系来源免疫细胞、至少十一种淋巴系来源免疫细胞，以及五种血管相关细胞亚群。细胞-细胞通讯网络分析显示，成纤维细胞和免疫细胞在小鼠ELG内密集的细胞间通讯网络中发挥着关键作用。结论：本研究提供了小鼠ELG的综合转录组图谱及相关数据库。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 健康小鼠眶外泪腺中存在哪些细胞类型？其异质性和复杂性如何？
- 核心机制
- 细胞间通讯网络由成纤维细胞和免疫细胞（尤其是巨噬细胞）主导，其中胶原信号通路在维持泪腺结构和功能中发挥关键作用，可能成为治疗靶点。
- 主要证据
- 单细胞RNA测序鉴定出超过37种细胞亚类，包括多种上皮细胞、成纤维细胞、免疫细胞和血管相关细胞；通过免疫荧光验证了多种分子标记物的表达；CellChat分析揭示了细胞间通讯网络，并指出胶原信号通路的重要性。
- 研究意义
- 提供了小鼠ELG的全面转录组图谱和数据库，加深了对泪腺发育、组成和功能的理解，并为泪腺疾病的发病机制和潜在治疗靶点（如胶原信号通路）奠定基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
单细胞RNA测序（scRNA-seq）
对所有细胞进行无偏转录组分析，鉴定细胞类型。
利用10X Genomics Chromium平台进行单细胞RNA测序，构建cDNA文库，并在Illumina HiSeq X Ten平台进行测序。
数据处理与细胞聚类分析
基于基因表达谱识别不同细胞群体。
使用Cell Ranger处理原始数据，Seurat进行聚类分析，UMAP降维可视化，利用Harmony整合数据以消除批次效应。
细胞类型鉴定与亚群分析
通过标记基因和免疫染色进一步确认各细胞类型及亚群。
基于已知标记基因对主要细胞类型进行鉴定，并对每个亚群进行重新聚类和差异基因分析；通过免疫组化和免疫荧光染色验证关键标记物。
细胞通讯网络分析
探索ELG中各细胞类型之间的相互作用网络。
使用CellChat软件对注释后的单细胞转录组数据进行细胞-细胞通讯分析，推断配体-受体相互作用，并可视化网络。
功能富集分析
揭示各细胞类型或亚群的潜在功能和显著通路。
对差异表达基因进行KEGG通路富集分析，以阐明不同细胞群体的功能特征。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
细胞通讯分析
功能富集分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 组织解离 | 胶原酶I | -- | -- |
| 胶原酶IV | -- | -- | |
| 脱氧核糖核酸酶I | -- | -- | |
| 红细胞裂解液 | QIAGEN | 8570396 | |
| 细胞纯化 | 死细胞去除试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-090-101 |
| 组织解离 | Eagle最小必需培养基 | -- | -- |
| 单细胞测序 | DynaBeads Myone硅烷磁珠 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Chromium单细胞控制器 | 10X Genomics | -- | |
| Illumina HiSeq X Ten平台 | Illumina | -- | |
| 免疫组化/免疫荧光 | 抗EpCAM兔多克隆抗体 | Servicebio | GB11274-100 |
| 抗前梯度蛋白2兔多克隆抗体 | Servicebio | GB111327-100 | |
| 抗α平滑肌肌动蛋白小鼠单克隆抗体 | Servicebio | GB12045-100 | |
| 抗ATP1B1兔多克隆抗体 | Servicebio | GB112432-100 | |
| 抗I型胶原兔多克隆抗体 | Servicebio | GB11022-3-100 | |
| 兔抗内皮抑素抗体 | Bioss | bs-0547R | |
| 抗DPP4/CD26兔多克隆抗体 | Servicebio | GB114937-100 | |
| 兔抗肌腱蛋白C抗体 | Bioss | bs-1327R | |
| 抗CD31小鼠单克隆抗体 | Servicebio | GB12063-100 | |
| 抗SDF1兔多克隆抗体（CXCL12） | Servicebio | GB11624-100 | |
| 抗血管性血友病因子兔多克隆抗体 | Servicebio | GB11020-100 | |
| 抗CD74兔多克隆抗体 | Servicebio | GB115427-100 | |
| 兔抗CX3CR1抗体 | Bioss | bs-1728R | |
| 抗甘露糖受体/CD206兔多克隆抗体 | Servicebio | GB113497-100 | |
| 抗CD11b兔多克隆抗体 | Servicebio | GB11058-100 | |
| 抗LY6C兔多克隆抗体 | Servicebio | GB115601-100 | |
| 兔抗NR2F6抗体（EAR2） | Bioss | bs-19340R | |
| 抗CD11c兔多克隆抗体 | Servicebio | GB11059-100 | |
| 抗Ki67小鼠单克隆抗体 | Servicebio | GB121141-100 | |
| 兔抗XCR1多克隆抗体 | Affinity | DF9046 | |
| 兔抗CD209/DC-SIGN抗体 | Bioss | bs-2239R | |
| 抗CCR7兔多克隆抗体 | Servicebio | GB11502-100 | |
| 抗CPA3兔多克隆抗体 | Servicebio | GB114968-100 | |
| 兔抗MCPT4抗体 | Bioss | bs-18733R | |
| MCPT-1（mMCP-1）单克隆抗体 | Thermo Fisher Scientific | 14-5503-80 | |
| 兔抗颗粒酶A抗体 | Bioss | bs-2578R | |
| 兔抗Styk1抗体 | Bioss | bs-5957R | |
| 抗CD3兔多克隆抗体 | Servicebio | GB11014-100 | |
| 抗CD8α兔多克隆抗体 | Servicebio | GB114196-100 | |
| 抗CD4抗体 | Servicebio | GB11064-100 | |
| 抗FOXP3兔多克隆抗体 | Servicebio | GB112325-100 | |
| 抗小鼠γδ T细胞受体（克隆GL3） | BD Biosciences | 553178 | |
| 兔抗IGBP1（CD709a）抗体 | Bioss | bs-0298R | |
| 兔抗JCHAIN抗体 | Bioss | bs-20180R | |
| 抗IgM链C兔多克隆抗体 | Servicebio | GB112040-100 | |
| 兔抗CCR9抗体 | Bioss | bs-1788R | |
| 兔抗SH3BGR抗体 | Bioss | bs-21170R | |
| 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 切片扫描仪（Pannoramic 250/MIDI） | 3D HISTECH | -- | |
| 同型对照抗体（兔IgG） | Servicebio | GB111738 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物与样本采集 | 小鼠品系、性别、年龄、来源、光照周期、饲养条件 阅读提示：Materials and methods - Animals |
| 单细胞悬液制备 | 消化酶种类及浓度、消化时间、过滤孔径、红细胞裂解和死细胞去除方法 阅读提示：Materials and methods - Tissue dissociation and single cell preparation |
| 单细胞RNA测序 | 测序平台、每样本加载细胞数、逆转录和PCR循环数、建库方法 阅读提示：Materials and methods - Single-cell RNA sequencing |
| 数据质量控制 | 基因数范围、线粒体基因比例阈值、双细胞去除方法 阅读提示：Materials and methods - Data processing and quality control |
| 细胞类型鉴定 | 聚类分辨率、标记基因选择、亚群分析参数 阅读提示：Materials and methods - Cell type identification |
| 细胞通讯分析 | CellChat软件版本、配体-受体数据库、交互阈值 阅读提示：Materials and methods - Cell–cell communication analysis |
| 免疫组化/免疫荧光 | 所用抗体、稀释比例、孵育条件、核染色方法 阅读提示：Materials and methods - Immunohistochemistry and immunofluorescence of murine ELG |