奶山羊非繁殖季节睾丸组织学、蛋白质表达和自噬的变化

Changes in histology, protein expression, and autophagy in dairy goat testes during nonbreeding season†

作者信息Huaming Xi, Fa Ren, Yu Li, Yeqing Du, Liqiang Wang, Jianhong Hu
PMID34467369
发布时间2021-11-15
DOI10.1093/biolre/ioab164

实验完整度

包含动物模型、组织学、ELISA、Western blot、TUNEL和TEM等实验,但主要为观察性检测,缺乏功能验证和机制验证。

主要模型

成年雄性关中奶山羊(10-12月龄)

重点核对

季节(4月非繁殖季 vs 10月繁殖季) 精液采集方式:电刺激法,每周两次,每只山羊3个精液样本 动物数量:精液和血液样本n=10,睾丸组织n=5 ELISA检测血清睾酮和FSH水平 Western blot检测蛋白表达,GAPDH为内参

摘要

季节性繁殖有助于提高某些动物后代的存活机会。奶山羊是季节性繁殖的哺乳动物。本研究使用成年雄性关中奶山羊(10-12月龄)。分析了奶山羊在繁殖季节(10月)和非繁殖季节(4月)的睾丸大小、精液质量、激素水平、生殖细胞凋亡和支持细胞自噬。我们发现,在奶山羊非繁殖季节,精液质量、促卵泡激素(FSH)水平、睾酮水平降低,凋亡生殖细胞数量增加。非繁殖季节奶山羊生殖细胞的增殖活性受到显著影响。然而,睾丸大小没有季节性变化。有趣的是,支持细胞自噬在非繁殖季节更为活跃。在非繁殖季节,奶山羊中FSH受体、Wilms肿瘤蛋白1、雄激素结合蛋白、胶质细胞源性神经营养因子和干细胞因子的表达水平降低。总之,我们的结果表明,奶山羊非繁殖季节的精子发生并未完全停滞。此外,奶山羊非繁殖季节生殖细胞凋亡和支持细胞形态发生显著变化。支持细胞自噬参与奶山羊精子发生的季节性调控。这些发现为季节性繁殖动物的生育能力和精子发生提供了重要见解。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
奶山羊非繁殖季节睾丸组织学、蛋白表达和自噬的变化及其与精子发生季节性调控的关系。
核心机制
非繁殖季节支持细胞自噬增强,FSH和睾酮水平降低,支持细胞功能相关蛋白(FSHR、WT1、ABP、GDNF、SCF)表达下调,可能导致生殖细胞增殖减少和凋亡增加。
主要证据
通过组织学、精液分析、ELISA、Western blot、TUNEL和TEM实验,发现非繁殖季节精液质量下降,凋亡生殖细胞增加,生殖细胞增殖活性降低,支持细胞自噬增强,支持细胞相关蛋白表达降低。
研究意义
为奶山羊非繁殖季节精液品质下降提供理论基础,有助于评估非繁殖季节优良公羊的繁殖价值。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

动物模型与样本采集

获取繁殖季和非繁殖季奶山羊的睾丸、精液和血液样本。

选用20只成年雄性关中奶山羊,分别在4月(非繁殖季)和10月(繁殖季)采集精液、血液和睾丸组织。

2

精液质量与激素水平分析

比较繁殖季和非繁殖季奶山羊的精液质量和激素水平变化。

使用光学显微镜评估精子浓度、活力、存活率和异常率;使用ELISA检测血清睾酮和FSH水平。

3

睾丸组织学与凋亡检测

观察睾丸组织学变化和生殖细胞凋亡情况。

对睾丸组织进行HE染色观察组织学;TUNEL检测凋亡生殖细胞。

4

蛋白表达分析

检测凋亡、增殖、支持细胞功能和自噬相关蛋白的表达。

Western blot检测BAX、BCL2、Cyt c、CASP3、FSHR、WT1、ABP、GDNF、SCF、PCNA、LC3、p62等蛋白表达。

5

自噬检测与超微结构分析

评估支持细胞自噬活性和超微结构变化。

Western blot检测LC3-II/I比值和p62水平;免疫组化定位LC3和p62;TEM观察支持细胞超微结构和自噬体。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

数据分析与统计

产品清单

实验环节名称品牌货号
Bouin固定液----
抗LC3抗体BIOSSbs-8878R
抗p62抗体Proteintech18420-1-AP
山羊抗兔IgG/HRP偶联物CWBIOCW0103S
睾酮ELISA试剂盒Nanjing Jiancheng Bioengineering InstituteH090-1-2
FSH ELISA试剂盒Nanjing Jiancheng Bioengineering InstituteH101-1-2
酶标仪BioTekSynergy H1
一步法TUNEL凋亡检测试剂盒BeyotimeC1089
DAPI----
RIPA裂解液----
BCA蛋白定量试剂盒TAINGENPA115
硝酸纤维素膜BosterAR0135-04
抗ABP抗体Proteintech18200-1-AP
抗BCL2抗体Proteintech12789-1-AP
抗BAX抗体Proteintech50599-2-Ig
抗CASP3抗体Proteintech19677-1-AP
抗细胞色素c抗体Proteintech10993-1-AP
抗FSHR抗体Proteintech22665-1-AP
抗GDNF抗体BIOSSbs-23586R
抗LC3抗体ServicebioGB11124
抗p62抗体Proteintech18420-1-AP
抗PCNA抗体Abcamab18197
抗SCF抗体BIOSSbs-0545R
抗WT1抗体Proteintech12609-1-AP
山羊抗小鼠IgG/HRP偶联物CWBIOCW0102S
山羊抗兔IgG/HRP偶联物CWBIOCW0103S
ECL底物Thermo Fisher Scientific34095
GAPDH抗体Proteintech10494-1-AP
醋酸铀酰----
柠檬酸铅----
HT7700透射电子显微镜Hitachi--
CKX53SF显微镜OLYMPUSCKX53SF

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
动物与样本采集
品种、年龄、季节选择、饲养条件、样本量、精液采集方法
阅读提示:Materials and methods: Animals; Collection of semen and blood samples
精液分析
电刺激频率、每次精液量、技术重复数、评估指标
阅读提示:Materials and methods: Collection of semen and blood samples
激素检测
血清分离条件、ELISA试剂盒、检测范围、重复性
阅读提示:Materials and methods: Enzyme-linked immunosorbent assays
组织学与免疫组化
固定方式、切片厚度、抗体稀释度、抗原修复条件、显色方法
阅读提示:Materials and methods: Histology and immunohistochemistry
凋亡检测
试剂盒、DAPI浓度、计数标准
阅读提示:Materials and methods: TUNEL assay
蛋白表达分析
组织裂解方法、蛋白定量方法、上样量、抗体稀释度、内参
阅读提示:Materials and methods: Protein extraction and western blot
自噬检测与超微结构
固定液、切片厚度、染色方法、电镜型号、自噬体计数标准
阅读提示:Materials and methods: TEM assay; Autophagy is involved in seasonal spermatogenesis