EGFR-TKIs抑制内皮细胞增殖
探究EGFR-TKIs对微血管内皮细胞增殖的影响
用不同浓度的afatinib、erlotinib、gefitinib处理HMEC-1和HMVEC，在24、48、72小时检测细胞增殖。
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EGFR酪氨酸激酶抑制剂诱发的紫癜性药疹与IQGAP1介导的血管通透性增加相关
Purpuric drug eruptions induced by EGFR tyrosine kinase inhibitors are associated with IQGAP1-mediated increase in vascular permeability
实验完整度
高包含细胞增殖实验、Western blot、RT-qPCR、免疫荧光、体外血管通透性实验、siRNA敲低、患者皮肤样本分析等体外和临床样本验证。
主要模型
HMEC-1永生化人真皮微血管内皮细胞 HMVEC人原代真皮微血管内皮细胞 HUVEC人脐静脉内皮细胞 EGFR-TKI治疗患者的皮损皮肤样本
重点核对
厄洛替尼处理HMEC-1的浓度和时间（0.1或1 μM，72小时） IQGAP1 siRNA敲低效率验证 跨内皮电阻（TER）测定方法及校正 体外血管通透性实验（ECM644试剂盒） 患者样本的免疫荧光染色（IQGAP1、pEGFR、CD31）
摘要
表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKIs）用于治疗非小细胞肺癌。已有一些关于EGFR-TKIs与血管不良事件相关的报道。我们发现EGFR-TKIs降低了HMEC-1s（永生化人真皮微血管内皮细胞）和HMVECs（人真皮微血管内皮细胞）的增殖，并抑制了EGFR和ERK的磷酸化。我们检测了厄洛替尼处理的HMEC-1s的mRNA表达谱，发现IQ基序含有GTP酶激活蛋白1（IQGAP1）是最一致上调的转录本和蛋白。IQGAP1在皮损皮肤中也过表达，并与内皮细胞共定位。值得注意的是，IQGAP1表达的增加与跨内皮电阻的降低及体外血管通透性的增加相关。厄洛替尼处理富集了细胞间接触部位的IQGAP1染色，并降低了α-catenin的强度。总之，厄洛替尼通过调节真皮内皮细胞中IQGAP1的表达诱导黏附连接功能障碍。© 2020 Pathological Society of Great Britain and Ireland. Published by John Wiley & Sons, Ltd.
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- EGFR酪氨酸激酶抑制剂诱发的紫癜性药疹的潜在机制是什么？
- 核心机制
- EGFR-TKI通过上调IQGAP1表达，导致α-catenin从黏附连接复合物中解离，破坏内皮细胞黏附连接，增加血管通透性，从而导致红细胞外渗和紫癜性药疹。
- 主要证据
- 体外实验显示厄洛替尼处理HMEC-1上调IQGAP1并降低TER及增加通透性；siIQGAP1敲低可恢复屏障功能；患者皮损中IQGAP1与CD31共定位。
- 研究意义
- 研究首次揭示EGFR-TKIs对人真皮微血管内皮细胞的影响，并提示IQGAP1可能作为治疗紫癜性药疹的潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
EGFR-TKIs抑制EGFR及下游信号通路
验证EGFR-TKIs对EGFR磷酸化和MAPK通路的影响
通过Western blot检测EGF刺激后EGFR、ERK、JNK、Akt的磷酸化水平。
鉴定厄洛替尼的转录靶点
寻找厄洛替尼调控的黏附连接相关基因
对厄洛替尼处理的HMEC-1进行cDNA微阵列分析，筛选差异表达基因，并用RT-qPCR和Western blot验证。
检测患者皮损中IQGAP1表达
验证IQGAP1在体内与紫癜性药疹的相关性
对正常皮肤和患者皮损进行免疫荧光染色，检测IQGAP1、pEGFR和CD31的表达与定位。
评估IQGAP1在内皮屏障功能中的作用
验证IQGAP1是否介导厄洛替尼诱导的屏障破坏
通过siRNA敲低HMEC-1中的IQGAP1，测定TER和FITC-dextran通透性。
分析厄洛替尼对黏附连接复合物的影响
探究厄洛替尼如何改变黏附连接蛋白表达和定位
用Western blot和免疫荧光检测VE-cadherin、catenin、F-actin及IQGAP1的表达和定位。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | EGM-2 MV培养基套装 | Lonza | CC-3202 |
| Medium 200培养基 | Gibco | M200500 | |
| 低血清生长添加剂套装 | Gibco | S-003-K | |
| 细胞增殖检测 | MTT | Sigma-Aldrich | -- |
| 基因表达检测 | TaqMan一步法RT-PCR预混液 | Applied Biosystems | -- |
| SuperScript第一链cDNA合成试剂盒 | Invitrogen | -- | |
| 基因功能抑制 | IQGAP1 siRNA慢病毒颗粒 | Santa Cruz Biotechnology | sc-35700 |
| FITC标记非靶向对照siRNA | Santa Cruz Biotechnology | sc-36869 | |
| GenMute转染试剂 | SignaGen Laboratories | SL100568 | |
| 屏障功能检测 | 体外血管通透性检测试剂盒 | Millipore | ECM644 |
| Millicell电阻系统 | Millipore | MERS00001 | |
| 免疫荧光染色 | 小鼠抗人IQGAP1单克隆抗体 | Thermo Fisher Scientific | 33-8900 |
| 兔抗磷酸化EGFR单克隆抗体 | Abcam | ab40815 | |
| 兔抗人CD31多克隆抗体 | Santa Cruz | sc-1506R | |
| 小鼠IgG1单克隆同型对照 | GeneTex | GTX35014 | |
| 兔IgG多克隆同型对照抗体 | Abcam | ab37415 | |
| 小鼠抗VE-钙黏蛋白单克隆抗体 | GeneTex | GTX633705 | |
| 兔抗VE-钙黏蛋白单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 2500S | |
| 兔抗IQGAP1多克隆抗体 | Bioss | bs-1109R | |
| 小鼠抗α-连环蛋白多克隆抗体 | GeneTex | GTX19446 | |
| 小鼠抗β-连环蛋白多克隆抗体 | GeneTex | GTX633010 | |
| FITC标记的鬼笔环肽 | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Aqua Polymount封片剂 | Polysciences, Inc | -- | |
| Western blot | 抗ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 9102S |
| 抗磷酸化ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 4370S | |
| 抗Akt抗体 | Cell Signaling Technology | 4691S | |
| 抗磷酸化Akt抗体 | Cell Signaling Technology | 4060S | |
| 抗JNK抗体 | Cell Signaling Technology | 9258S | |
| 抗磷酸化JNK抗体 | Cell Signaling Technology | 9255S | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 3700S | |
| 抗β-连环蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 8480S | |
| 抗ITGA5抗体 | Abcam | ab150361 | |
| 抗EGFR抗体 | Abcam | ab2430 | |
| 抗磷酸化EGFR抗体 | Abcam | ab40815 | |
| 抗E-钙黏蛋白抗体 | GeneTex | GTX100443 | |
| 抗ACTN3抗体 | GeneTex | GTX103216 | |
| 抗LMO7抗体 | GeneTex | GTX56232 | |
| 抗PVRL1抗体 | GeneTex | GTX130824 | |
| 抗IQGAP1抗体 | Santa Cruz | sc-376021 | |
| 微阵列实验 | 低起始量Quick-Amp标记试剂盒 | Agilent Technologies | -- |
| Cy3荧光染料 | Agilent Technologies | -- | |
| 安捷伦 SurePrint G3 人类V2 GE 8x60K 微阵列 | Agilent Technologies | -- | |
| 安捷伦微阵列扫描仪 | Agilent Technologies | -- | |
| 统计分析 | SPSS 20.0版本 | IBM Corporation | -- |
| 细胞增殖检测 | SpectraMax M5酶标仪 | Molecular Devices | -- |
| 显微镜 | 蔡司510/META/NLO共聚焦显微镜 | Carl Zeiss | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞类型（HMEC-1、HMVEC、HUVEC）、培养基（EGM-2 MV、Medium 200）、培养条件（37°C，5% CO2） 阅读提示：Materials and methods: Endothelial cells and origin |
| 细胞增殖实验 | 药物（afatinib、erlotinib、gefitinib）、浓度（0.01、0.1、1 μM）、处理时间（24、48、72小时） 阅读提示：Materials and methods: Cell proliferation assay; Results: EGFR-TKIs inhibit HMEC-1 and HMVEC proliferation in a time-dependent manner |
| 信号通路分析 | EGF刺激浓度（100 ng/ml）和时长（2小时）、EGFR-TKI预处理浓度和时间（1小时）、检测蛋白（pEGFR、pERK、pJNK、pAkt） 阅读提示：Materials and methods: Western blotting analysis; Results: Inhibition of EGFR and its downstream signaling pathways by EGFR-TKIs |
| 基因表达分析 | 厄洛替尼浓度（0.1或1 μM）和处理时间（72小时）、筛选标准（差异>2倍）、验证方法（RT-qPCR、western blot） 阅读提示：Materials and methods: Microarray experiment, RT-qPCR; Results: Identification of endogenous RNA targets for EGFR-TKIs |
| 屏障功能测定 | siRNA敲低IQGAP1（siIQGAP1或Scr）、厄洛替尼浓度（0.1或1 μM）和处理时间（72小时）、TER测定方法和通透性检测 阅读提示：Materials and methods: Analysis of HMEC-1 monolayer permeability; Results: Functional impact of IQGAP1 in human dermal microvascular endothelial cells |
| 免疫荧光染色 | 一抗类型和稀释度（如IQGAP1 1:250、pEGFR 1:200、CD31 1:50）、细胞固定方法（甲醇）、组织切片厚度（7 μm） 阅读提示：Materials and methods: Immunofluorescence staining |