建立直接共培养体系并分离细胞
模拟肿瘤微环境中癌细胞与CAF前体细胞的直接接触，并分离出高纯度的癌细胞和CAF样细胞。
将ESCC细胞系（TE-9、TE-10、TE-15）与骨髓来源MSC直接共培养4天，通过EpCAM磁珠分离获得TE-co和CAF样细胞。
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骨髓基质细胞抗原2通过介导癌细胞与肿瘤相关成纤维细胞之间的细胞间相互作用促进食管鳞状细胞癌进展
Bone Marrow Stromal Cell Antigen 2 Promotes Esophageal Squamous Cell Carcinoma Progression by Mediating the Cell-Cell Interaction between Cancer Cells and Cancer-Associated Fibroblasts
实验完整度
高包含体外共培养模型、细胞功能验证（增殖、迁移、粘附）、信号通路（ERK）机制验证以及临床样本免疫组化预后分析等多个独立证据层级。
主要模型
ESCC细胞系（TE-9、TE-10、TE-15）与骨髓间充质干细胞直接共培养体系 人骨髓来源间充质干细胞（MSC） ESCC患者肿瘤组织样本（66例） ESCC单细胞RNA测序公共数据集（GSE160269）
重点核对
直接共培养时间：4天 BST2敲低：siRNA（10 nmol/L，48小时转染） BST2过表达：pRP[Exp]-EGFP/Neo-CMV>hBST2载体 细胞活力检测：MTS法（CellTiter 96 Aqueous One Solution） 迁移实验：Transwell小室（8.0 μm孔径），48小时 粘附实验：纤连蛋白包被培养板，3小时 临床样本：66例ESCC组织，免疫组化评分（0-3分）
摘要
食管鳞状细胞癌（ESCC）微环境中的肿瘤相关成纤维细胞（CAF）通过与癌细胞的细胞间相互作用促进癌症进展。已建立一种通过将人骨髓来源间充质干细胞（MSC）（已知的CAF来源）与ESCC细胞直接共培养来生成CAF样细胞的方法。使用该方法，对单独培养和共培养的ESCC或MSC进行了cDNA微阵列分析。在本研究中，研究了骨髓基质细胞抗原2（BST2），其在共培养后的ESCC细胞和CAF样细胞中均显著表达，并可能参与细胞间相互作用。在来自ESCC组织的公共单细胞RNA测序数据数据库中，BST2在癌细胞和CAF中显著表达，结果强烈提示CAF与表达BST2的癌细胞之间存在相互作用。共培养的ESCC细胞和CAF样细胞通过细胞外信号调节激酶信号通路表现出增强的增殖、迁移和粘附能力，BST2参与了这些表型。此外，BST2促进了直接共培养中MSC与ESCC细胞之间的粘附。免疫组织化学表明，BST2高表达，尤其是在癌症间质中，与ESCC患者的不良临床病理因素和较差预后显著相关。总之，BST2通过促进肿瘤微环境中癌细胞与CAF之间的细胞间相互作用，促进ESCC进展。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 鉴定在ESCC细胞和CAF中均上调、可能通过直接细胞间相互作用促进ESCC进展的分子。
- 核心机制
- BST2通过激活ERK信号通路，促进ESCC细胞和CAF样细胞的增殖、迁移、粘附，并介导癌细胞与CAF之间的细胞粘附，从而促进ESCC进展。
- 主要证据
- 直接共培养后，BST2在ESCC细胞和CAF样细胞中均显著上调（cDNA微阵列、qRT-PCR、Western blot）；敲低或过表达BST2影响细胞存活、生长、迁移和粘附，并改变pERK水平；免疫荧光显示BST2影响ESCC细胞与MSC/CAF之间的粘附；临床样本免疫组化显示间质BST2高表达与不良预后相关。
- 研究意义
- BST2可能作为ESCC的治疗靶点，加深对肿瘤微环境中癌细胞与CAF相互作用的理解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
筛选共培养后上调和共表达的基因
识别在ESCC细胞和CAF中均上调的基因，重点关注介导细胞间相互作用的分子。
重新分析cDNA微阵列数据，通过Venn图筛选在TE-9 co和CAF9中均高表达的基因，确定BST2为研究对象。
验证共培养后BST2表达上调
确认BST2在共培养的ESCC细胞和CAF样细胞中mRNA和蛋白水平均显著上调。
通过qRT-PCR和Western blot检测不同细胞系中BST2的表达，并使用非还原条件检测二聚体形式。
验证BST2对ESCC细胞恶性表型的影响
评估敲低或过表达BST2对ESCC细胞存活、生长、迁移和粘附的影响，并初步探索信号通路。
在ESCC细胞中转染siBST2或oeBST2，进行MTS、Transwell迁移和粘附实验，并通过Western blot检测pERK水平。
验证直接共培养条件下BST2对ESCC细胞和CAF样细胞恶性表型的影响
在生理相关的直接共培养条件下，验证BST2对癌细胞和CAF样细胞恶性表型的促进作用。
在共培养期间转染siBST2，分离细胞后检测存活、生长、迁移和粘附能力，并分析pERK变化。
验证BST2对MSC向CAF样细胞激活的影响
评估BST2是否促进MSC获得CAF样恶性表型。
在MSC中敲低或过表达BST2，检测其存活、生长、迁移和粘附能力，并检测pERK水平。
验证BST2介导ESCC细胞与MSC/CAF之间的细胞粘附
验证BST2是否直接参与癌细胞与基质细胞之间的细胞间粘附。
敲低或过表达BST2后，将ESCC细胞与MSC或CAF直接共培养，通过免疫荧光检测粘附的癌细胞数量。
临床样本中BST2表达与预后的关联分析
评估BST2在ESCC组织中的表达水平与临床病理因素及患者预后的关系。
对66例ESCC组织进行免疫组化染色，评分并分组，进行Kaplan-Meier生存分析和临床病理相关分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证机制链路
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | -- |
| 胎牛血清 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 青霉素-链霉素-两性霉素B悬液 | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | -- | |
| 低糖DMEM培养基 | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | -- | |
| 高糖DMEM培养基 | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | -- |
| TransIT-LT1转染试剂 | Mirus Bio LLC | -- | |
| Lipofectamine Stem转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 细胞分离 | 抗CD326（EpCAM）微珠 | Miltenyi Biotec | 130-061-101 |
| autoMACS Pro分离器 | Miltenyi Biotec | -- | |
| RNA提取 | RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | -- |
| RNA定量 | NanoDrop Lite分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 定量PCR | StepOne实时PCR系统 | Applied Biosystems | -- |
| SYBR Green预混液 | Applied Biosystems | -- | |
| 蛋白质提取 | 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 | Sigma-Aldrich | -- |
| Western blot | SDS上样缓冲液 | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | -- |
| 5%-20%梯度凝胶 | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | -- | |
| iBlot2系统 | Invitrogen | -- | |
| ImmunoStar试剂 | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | -- | |
| ImageQuant LAS4000 mini成像仪 | Fujifilm | -- | |
| 兔抗BST2抗体 | Proteintech | 13560-1-AP | |
| 兔抗ERK抗体 | Cell Signaling Technology | 9102 | |
| 兔抗磷酸化ERK抗体 | Cell Signaling Technology | 9101 | |
| 兔抗STAT3抗体 | Cell Signaling Technology | 12640 | |
| 兔抗磷酸化STAT3抗体 | Cell Signaling Technology | 9131 | |
| 兔抗NF-κB p65抗体 | Cell Signaling Technology | 8242 | |
| 兔抗磷酸化NF-κB p65抗体 | Cell Signaling Technology | 3033 | |
| 兔抗AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 9262 | |
| 兔抗磷酸化AKT（Ser473）抗体 | Cell Signaling Technology | 4060 | |
| 兔抗磷酸化AKT（Thr308）抗体 | Cell Signaling Technology | 2965 | |
| 兔抗p38 MAPK抗体 | Cell Signaling Technology | 9212 | |
| 兔抗磷酸化p38 MAPK抗体 | Cell Signaling Technology | 9211 | |
| 兔抗β-actin抗体 | Cell Signaling Technology | 4970 | |
| 辣根过氧化物酶偶联的驴抗兔IgG | Cytiva | NA934V | |
| 辣根过氧化物酶偶联的抗小鼠IgG | Cytiva | NA931V | |
| 细胞功能实验 | CellTiter 96 Aqueous One Solution试剂 | Promega | -- |
| Infinite 200 PRO酶标仪 | Tecan | -- | |
| 迁移实验 | 细胞培养小室（孔径8.0 μm） | BD Falcon | -- |
| Diff-Quik染色液 | Sysmex | -- | |
| 粘附实验 | 人纤连蛋白 | Sigma-Aldrich | -- |
| 免疫荧光 | 兔抗BST2抗体 | Proteintech | 13560-1-AP |
| 兔抗EpCAM抗体 | Cell Signaling Technology | 2929 | |
| 羊抗FAP抗体 | R&D Systems | AF3715 | |
| DAPI | Fujifilm Wako Pure Chemical Corp. | 340-07971 | |
| Alexa Fluor-647偶联的抗兔IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 711-605-152 | |
| Cy3偶联的抗小鼠IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 715-165-150 | |
| Alexa Fluor-488偶联的抗羊IgG | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 713-545-003 | |
| 共聚焦激光扫描显微镜LSM700 | Carl Zeiss | -- | |
| 免疫组化 | Leica BOND-MAX自动染色系统 | Leica Biosystems | -- |
| BOND Polymer Refine检测试剂盒 | Leica Biosystems | -- | |
| 兔抗BST2抗体 | Proteintech | 13560-1-AP | |
| 数据分析 | IBM SPSS Statistics软件版本22 | IBM Corp. | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 直接共培养 | MSC接种密度，ESCC细胞接种密度，共培养时间，培养基成分（高糖DMEM+10%FBS+1%抗生素） 阅读提示：Materials and Methods: Direct Co-Culture System |
| BST2敲低 | siRNA浓度（10 nmol/L），转染时间（48小时），转染试剂（Lipofectamine RNAiMAX） 阅读提示：Materials and Methods: Knockdown and Overexpression of BST2 |
| BST2过表达 | 质粒构建（pRP[Exp]-EGFP/Neo-CMV>hBST2），转染试剂（TransIT-LT1或Lipofectamine Stem） 阅读提示：Materials and Methods: Knockdown and Overexpression of BST2 |
| 细胞功能实验 | 细胞接种密度（存活、生长、迁移、粘附实验），处理时间（48小时等），检测试剂（MTS） 阅读提示：Materials and Methods: Cell Survival and Growth Assay, Transwell Migration Assay, Cell Adhesion Assay |
| 临床样本分析 | 样本量（66例），染色评分标准（0-3分），生存分析类型（OS, CSS, DFS） 阅读提示：Materials and Methods: Tissue Samples, Immunohistochemistry; Results: 图10 |