单核转录组分析鉴定疾病相关肝细胞亚群
鉴定健康与MASH肝脏中肝细胞亚群及其转录特征，特别是是否存在富集衰老标志物的亚群。
对喂食正常饮食或MASH饮食5个月的小鼠肝脏进行snRNA-seq，聚类分析鉴定肝细胞亚群，计算衰老基因评分。
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THEMIS通过抑制疾病相关肝细胞诱导和肝细胞衰老缓解小鼠代谢功能障碍相关脂肪性肝炎
THEMIS attenuates MASH by suppressing disease-associated hepatocyte induction and hepatocyte senescence in mice
实验完整度
高包含snRNA-seq、全身和肝细胞特异性敲除、AAV过表达、原代肝细胞及细胞系体外实验等多层级验证。
主要模型
饮食诱导MASH小鼠模型 肝细胞特异性Themis敲除小鼠 p21-Cre转基因小鼠 原代小鼠及人肝细胞
重点核对
MASH饮食喂养时长（3或5个月）及饮食成分 AAV注射时机及剂量（1×10^11基因组拷贝/只） 他莫昔芬剂量及给药方式（20mg/mL，腹腔注射4天） 体外处理条件（PA/OA浓度300μM，EGF 100ng/mL，Dox 1μM等） 样本量及统计方法（t检验或ANOVA）
摘要
肝细胞衰老日益被认为是代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）的致病驱动因素。通过单核转录组分析，我们在MASH肝脏中鉴定出一个离散的疾病相关肝细胞（daHep）群体，其富集衰老标志物。衰老肝细胞的出现与小鼠和人MASH中肝脏胸腺细胞选择相关（THEMIS）表达的显著诱导相关。全局或肝细胞特异性敲除Themis导致daHep和衰老肝细胞群体显著扩增，并加重小鼠MASH病理。单核转录组分析揭示THEMIS在塑造MASH肝脏微环境中实质和非实质区室的细胞景观中发挥核心作用。相反，腺相关病毒介导的THEMIS过表达抑制肝细胞衰老并减轻饮食诱导的MASH。机制研究表明，THEMIS缺陷促进异常的ERK磷酸化和肝细胞衰老。这些发现将THEMIS确立为关键的肝脏保护因子，其抑制肝细胞衰老并减轻代谢性肝病进展。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- THEMIS在MASH进展中是否作为肝保护因子发挥作用，其机制是否涉及抑制肝细胞衰老？
- 核心机制
- THEMIS通过抑制ERK信号通路（可能通过结合GRB2并抑制RAS活性）来抑制肝细胞衰老和daHep诱导。
- 主要证据
- snRNA-seq鉴定daHep亚群；Themis敲除加重MASH表型并增加衰老标志物；AAV介导的THEMIS过表达减轻肝细胞衰老和MASH；体外实验显示THEMIS抑制ERK磷酸化。
- 研究意义
- THEMIS是MASH中的关键肝保护因子，可能作为代谢性肝病的治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证THEMIS在MASH肝脏中的诱导表达
验证THEMIS在MASH肝脏中的表达变化，并探索其诱导因素。
通过qPCR、免疫印迹和RNAscope检测小鼠和人肝脏中THEMIS表达；用脂肪酸和细胞因子处理原代肝细胞，检测Themis表达。
评估Themis敲除对MASH病理的影响
通过全身和肝细胞特异性敲除，评估Themis缺失对饮食诱导MASH进展的影响。
对WT和Themis-KO或Flox和HKO小鼠喂食MASH饮食，分析肝功能、脂质积累、纤维化、炎症和衰老标志物。
单核转录组分析THEMIS对肝脏细胞景观的影响
揭示肝细胞THEMIS缺失如何重塑肝实质和非实质细胞的转录状态。
对MASH饮食喂养的Flox和HKO小鼠肝脏进行snRNA-seq，分析肝细胞亚群、HSC和巨噬细胞亚群的变化。
体外机制研究：THEMIS对ERK信号和衰老的影响
探究THEMIS抑制肝细胞衰老的分子机制，特别是对ERK信号通路的影响。
分离原代肝细胞，用EGF刺激检测ERK磷酸化；用腺病毒过表达THEMIS，检测Dox诱导的衰老表型；用MEK抑制剂trametinib处理验证THEMIS作用位点。
体内过表达验证THEMIS的保护作用
验证肝细胞特异性过表达THEMIS是否足以减轻MASH病理。
通过AAV-TBG-Themis或AAV-TBG-DIO-THEMIS在MASH饮食小鼠肝细胞中过表达THEMIS，分析代谢参数、组织学、衰老标志物等。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
细胞功能分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 饮食诱导MASH模型 | D09100310饮食 | Research Diets | -- |
| 他莫昔芬给药 | 他莫昔芬 | Sigma | T5648 |
| 细胞培养处理 | SHP099抑制剂 | MedChemExpress | HY-100388 |
| 小鼠EGF重组蛋白 | Thermo Fisher | PMG8044 | |
| 阿霉素 | Cayman | 15007 | |
| 曲美替尼 | MedChemExpress | HY-10999 | |
| RNAscope | RNAscope多重荧光试剂盒v2 | Advanced Cell Diagnostics | UM |
| RNAscope过氧化氢 | Advanced Cell Diagnostics | 2018518 | |
| RNAscope蛋白酶IV | Advanced Cell Diagnostics | 2018519 | |
| 人类THEMIS探针 | Advanced Cell Diagnostics | 551661 | |
| 小鼠Nrg1探针 | Advanced Cell Diagnostics | 418181 | |
| 小鼠Cdkn1a探针 | Advanced Cell Diagnostics | 408551-C2 | |
| TSA Vivid荧光染料570 | Advanced Cell Diagnostics | 323272 | |
| TSA Vivid荧光染料650 | Advanced Cell Diagnostics | 323273 | |
| SA-β-Gal染色 | 衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒 | Cell Signaling Technology | 9860 |
| 免疫印迹 | 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 1187358001 |
| Bio-Rad蛋白定量试剂盒 | Bio-Rad | 5000006 | |
| BrightStar Duration HRP化学发光底物ECL试剂盒 | Alkali Scientific Inc | XR92 | |
| Clarity Western ECL底物 | Bio-Rad | 1705060S | |
| 抗THEMIS抗体 | Abcam | ab126771 | |
| 抗p21抗体 | Cell Signaling Technology | 2947 | |
| 抗NRG1抗体 | Boster Bio | PA1969 | |
| 抗ANXA2抗体 | Cell Signaling Technology | 8235 | |
| 抗Hsp90抗体 | Santa Cruz | Sc-13119 | |
| 抗磷酸化Erk抗体 | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| 抗Erk抗体 | Cell Signaling Technology | 4695 | |
| 抗磷酸化p38抗体 | Cell Signaling Technology | 9215 | |
| 抗磷酸化JNK抗体 | Cell Signaling Technology | 4668 | |
| 抗磷酸化NF-κB抗体 | Cell Signaling Technology | 3033 | |
| 衰老标志物抗体套装 | Cell Signaling Technology | 56062 | |
| 抗GRB2抗体 | ABclonal | A19059 | |
| 抗Flag抗体 | Sigma | F1804 | |
| 免疫荧光 | 抗DESMIN抗体 | Thermo Fisher | RB-9014-P1 |
| 抗F4/80抗体 | Bio-Rad | MCA497G | |
| 抗CK8抗体 | Developmental Studies Hybridoma Bank | TROMA-I | |
| 免疫沉淀 | 抗Flag M2磁珠 | Sigma | A2220 |
| 抗HA琼脂糖珠 | Thermo Fisher | 26181 | |
| RAS活性测定 | RAS pull-down激活测定生化试剂盒 | Cytoskeleton | BK008 |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Alkali Scientific | TRZ-100 |
| qPCR | SYBR Green染料 | Fisher Scientific | 44-729-20 |
| 血浆检测 | AST检测试剂盒 | Teco Diagnostics | A524-150 |
| ALT检测试剂盒 | Wako | 995-34791 | |
| 流式细胞术 | Optiprep溶液 | Serumwerk | 1893 |
| Pacific Blue抗小鼠CD45抗体 | BioLegend | 103126 | |
| PE/Cyanine7抗小鼠F4/80抗体 | BioLegend | 123114 | |
| PerCP/Cyanine5.5抗小鼠CD11b抗体 | BioLegend | 101227 | |
| 测序建库 | NEBNext Poly(A) mRNA磁性分离模块 | NEB | E7490 |
| NEBNext UltraExpress RNA文库制备试剂盒 | NEB | E3330 | |
| 单核RNA-seq | Protector RNA酶抑制剂 | Sigma | 3335399001 |
| 碘化丙啶 | Sigma | P4170 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 饮食诱导MASH模型 | MASH饮食成分及喂养时长（3或5个月；AAV实验12或14周后再喂8或6周） 阅读提示：Methods: 饮食诱导MASH小鼠模型；图3、4、7、8图注 |
| AAV介导的基因操作 | AAV血清型（AAV8）、启动子（TBG）、剂量（1×10^11基因组拷贝/只）、注射方式（尾静脉） 阅读提示：Methods: 饮食诱导MASH小鼠模型；质粒构建；图4、7、8 |
| 他莫昔芬诱导 | 他莫昔芬剂量（20mg/mL溶于玉米油）、给药方式（腹腔注射）、连续4天 阅读提示：Methods: 饮食诱导MASH小鼠模型；图8A |
| 原代肝细胞培养与处理 | 分离方法（胶原酶消化）、处理条件（PA/OA浓度、EGF浓度、Dox浓度和时长、trametinib浓度） 阅读提示：Methods: 体外肝细胞处理；图2、6 |
| 衰老检测 | SA-β-Gal染色试剂盒和步骤、p21免疫荧光、RNAscope探针 阅读提示：Methods: 衰老染色；RNAscope原位杂交；图1、6、7、8 |