分离和鉴定肠道共生真菌Engyodontium
获得可培养的肠道共生真菌菌株，并确认其分类学身份。
使用Dectin-2-Fc融合蛋白从小鼠粪便中磁性纯化真菌，通过ITS测序鉴定为Engyodontium sp.，并在PDA培养基上培养。
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结肠Engyodontium真菌触发中性粒细胞抗菌活性以抑制约氏乳杆菌来源的谷氨酸维持的调节性T细胞
Colonic Engyodontium fungus triggers neutrophil antimicrobial activity to suppress Lactobacillus johnsonii-derived glutamic acid-maintained Tregs
实验完整度
高包含小鼠体内模型、体外细胞共培养、中性粒细胞和Treg功能实验、代谢组学、微生物组分析及患者样本验证等多层级证据，并明确进行了功能验证（如中和抗体、基因敲除）和机制验证。
主要模型
小鼠DSS诱导结肠炎模型 WT与Clec4n–/–小鼠 WT与Card9–/–小鼠 NCM460人肠上皮细胞系
重点核对
Engyodontium给药剂量为5×10^8 CFU/只，口服给药 DSS浓度为1.5%，给予7天 抗CD25单抗剂量为100 μg/只，腹腔注射 小鼠品系为C57BL/6J背景的Clec4n–/–、Card9–/–和WT小鼠 中性粒细胞耗竭使用抗Ly6G单抗，剂量为100 μg/只
摘要
从鼠肠道中分离共生真菌一直具有挑战性，限制了我们对它们在肠道免疫稳态和疾病中的作用的理解。利用C型凝集素受体Dectin-2的Fc融合蛋白，我们成功地从鼠粪便中纯化出共生子囊菌Engyodontium sp.。Engyodontium通过CARD9通路增强结肠中性粒细胞的抗菌活性，并通过损害肠道约氏乳杆菌WXY株的定植加剧结肠炎。约氏乳杆菌通过表达编码谷氨酰胺酶的glsA基因产生高水平的L-谷氨酸，通过增强IL-2受体信号传导促进Treg细胞扩增。克罗恩病和溃疡性结肠炎患者中的Engyodontium丰度增加，约氏乳杆菌丰度降低。Engyodontium直接诱导人结肠中性粒细胞中的钙卫蛋白，CD患者的L-谷氨酸水平较低，这也促进了人Treg细胞的扩增。这些发现强调了Engyodontium-钙卫蛋白轴对抗乳杆菌-谷氨酸-Treg级联反应加剧结肠炎，提示共生Engyodontium触发的信号可作为黏膜炎症性疾病的治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 肠道共生真菌Engyodontium如何影响肠道免疫稳态和结肠炎的发生？
- 核心机制
- Engyodontium通过Dectin-2/CARD9信号通路增强结肠中性粒细胞的抗菌活性，促进钙卫蛋白（S100A8/S100A9）产生，从而抑制约氏乳杆菌WXY株的定植，减少其通过glsA产生的L-谷氨酸，进而削弱Treg细胞的扩增（通过增强IL-2受体信号），最终加剧结肠炎。
- 主要证据
- 在小鼠DSS结肠炎模型中，Engyodontium定植加重疾病，而Clec4n–/–或Card9–/–小鼠免受加剧；中性粒细胞耗竭或TRAF6抑制逆转效应；L.j. WXY及其培养上清（而非热灭活菌）减轻结肠炎并增加Treg，L-谷氨酸处理模拟该保护作用；患者样本显示Engyodontium、CLEC6A和钙卫蛋白增加，L. johnsonii和谷氨酸减少。
- 研究意义
- 揭示Engyodontium–Dectin-2–钙卫蛋白轴对肠道微生物和免疫的调控，为IBD等黏膜炎症性疾病提供潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证Engyodontium对肠道免疫和微生物群的影响
探究Engyodontium定植对肠道免疫细胞和微生物群组成的影响。
对SPF小鼠进行Engyodontium口服定植，通过流式细胞术检测cLP中性粒细胞和Treg细胞，用16S rDNA测序分析粪便菌群。
分析Engyodontium诱导的结肠炎恶化机制
确定Engyodontium通过何种信号通路加重DSS诱导的结肠炎。
在WT、Clec4n–/–和Card9–/–小鼠中诱导DSS结肠炎，比较疾病严重程度、中性粒细胞浸润和Treg频率。
鉴定受抑制的益生菌L.j. WXY及其代谢物
确认Engyodontium抑制的肠道细菌种类及其发挥保护作用的关键代谢物。
从Clec4n–/–小鼠粪便中分离L.j. WXY，通过代谢组学分析其分泌的代谢物，并进行DSS结肠炎保护实验。
验证L-谷氨酸促进Treg分化并缓解结肠炎
验证L-谷氨酸是否通过促进Treg分化来减轻DSS诱导的结肠炎。
在体外Treg分化实验中加入L-谷氨酸，检测Treg比例和Il2ra等基因表达；体内口服L-谷氨酸并评估DSS结肠炎严重程度。
在人体样本中验证Engyodontium–DECTIN-2轴的临床相关性
评估Engyodontium、DECTIN-2、钙卫蛋白和L. johnsonii在IBD患者中的相关性，并验证L-谷氨酸对人Treg的作用。
分析CD和UC患者粪便中Engyodontium和L. johnsonii丰度，结肠组织中CLEC6A、S100A8/A9表达及谷氨酸水平，并用人外周血T细胞验证L-谷氨酸促进FOXP3+ Treg分化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 流式细胞术 | 抗小鼠CD45抗体 | BioLegend | 103116 |
| 抗小鼠CD11b抗体 | BioLegend | 101216 | |
| 抗小鼠Ly6G抗体 | BioLegend | 127606 | |
| 抗小鼠Foxp3抗体 | BioLegend | 126403 | |
| RT-qPCR | SYBR Green预混液 | Agbio | Ag11701 |
| QuantStudio 5实时荧光定量PCR系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| IHC | 抗DECTIN-2抗体 | Affinity Biosciences | DF10182 |
| 抗S100A8抗体 | Affinity Biosciences | DF6556 | |
| 抗S100A9抗体 | Affinity Biosciences | DF7596 | |
| Leica DM6FS显微镜 | Leica Camera AG | -- | |
| 16S rDNA-Seq | AMPure XT磁珠 | Beckman Coulter Genomics | -- |
| Illumina MiSeq测序平台 | Illumina | -- | |
| 代谢组学分析 | UHPLC-Q Exactive HF-X系统 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 微生物培养 | MRS琼脂 | Solarbio | -- |
| PDA培养基 | Solarbio | -- | |
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 胶原酶 | Sigma-Aldrich | C5138-1 | |
| 脱氧核糖核酸酶 | Solarbio | D8070 | |
| 细胞分离 | Percoll分离液 | Cytiva Life Sciences | 17-0891-01 |
| 流式细胞术 | 佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯 | Merck Millipore | P1585 |
| 离子霉素 | Merck Millipore | 56092-82-1 | |
| 莫能菌素 | Merck Millipore | 475895 | |
| Foxp3/转录因子固定/破膜试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 00-5123-43 | |
| RT-qPCR | 哺乳动物总RNA小提试剂盒 | Sigma-Aldrich | RTN350-1KT |
| Evo M-MLV逆转录预混液 | Agbio | AG11706 | |
| 粪便DNA提取 | QIAamp粪便DNA小提试剂盒 | Qiagen | 51504 |
| DSS诱导结肠炎 | 葡聚糖硫酸钠 | MP Biomedicals | 9011-18-1 |
| 抗菌肽处理 | 重组S100A8 | MCE | HY-P71076 |
| 重组S100A9 | MCE | HY-P71076 | |
| 细胞培养 | 巨噬细胞集落刺激因子 | PeproTech | 315-02 |
| 粒细胞集落刺激因子 | PeproTech | 250-05 | |
| 细胞刺激 | α-甘露聚糖 | Sigma-Aldrich | 9036-88-8 |
| Treg分化 | 重组TGF-β | Sino Biological | 80116-RNAH |
| 重组IL-2 | PeproTech | 212-12 | |
| L-谷氨酸 | Solarbio | IG0710 | |
| Dynabeads小鼠T细胞激活磁珠CD3/CD28 | Thermo Fisher Scientific | 11456D | |
| 人Treg分化 | 淋巴细胞分离液 | STEMCELL Technologies | 07851 |
| Dynabeads人T细胞激活磁珠CD3/CD28 | Thermo Fisher Scientific | 11161D | |
| 抗CD25抗体处理 | 抗小鼠CD25抗体 | Bio X Cell | BE0012 |
| 对照IgG | Bio X Cell | BE0088 | |
| 真菌分离 | pFUSE-hIgG2-Fc2载体 | InvivoGen | -- |
| 蛋白A-琼脂糖 | BioVision | -- | |
| 真菌培养 | 马铃薯葡萄糖肉汤培养基 | Solarbio | -- |
| 乳酸酚棉蓝 | Leagene | DM0080 | |
| ELISA | 小鼠IL-1β ELISA试剂盒 | BioLegend | 432601 |
| 小鼠IL-6 ELISA试剂盒 | HUABIO | EM0004 | |
| 小鼠TNF-α ELISA试剂盒 | HUABIO | EM0010 | |
| 小鼠S100A8/S100A9 ELISA试剂盒 | JINGMEI | WJM-13029M1 | |
| 免疫荧光 | 抗CXCL2抗体 | Abcam | ab317569 |
| 抗Dectin-2抗体 | GeneTex | GTX41453 | |
| 抗Ly6G抗体 | HUABIO | 0809-11 | |
| DAPI染色液 | Solarbio | S2110 | |
| Leica DM6B荧光显微镜 | Leica Camera AG | -- | |
| 谷氨酸测定 | 谷氨酸含量测定试剂盒 | Beijing Boxbio Science & Technology Co. | -- |
| 抗生素处理 | 卡那霉素 | Macklin | 25389-94-0 |
| 庆大霉素 | Macklin | 1405-41-0 | |
| 粘菌素 | Macklin | 1264-72-8 | |
| 甲硝唑 | Macklin | 443-48-1 | |
| 万古霉素 | Macklin | 1404-93-9 | |
| 红霉素 | Macklin | 114-07-8 | |
| 微生物培养 | 新霉素 | Macklin | 1405-10-3 |
| 试剂 | 生物素化抗人IgG Fc抗体 | Abcam | ab97223 |
| 抗生物素磁珠 | BioLegend | -- | |
| EasySep磁分离系统 | STEMCELL Technologies | -- | |
| 博来霉素 | MKBio | -- | |
| 聚乙烯亚胺 | Beyotime | -- | |
| Bio-Rad纯化系统 | Bio-Rad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 真菌分离与鉴定 | Dectin-2-Fc融合蛋白的浓度和孵育时间；磁珠和分离试剂盒的型号；PDA培养基的培养温度和时间。 阅读提示：Methods: Isolation of fungi using Dectin-1/2-Fc fusion proteins; Generation of Dectin-1/2-Fc fusion proteins |
| 小鼠定植与DSS结肠炎模型 | Engyodontium的给药剂量和频率（5×10^8 CFU，隔日一次，共3次）；DSS浓度（1.5%）和给药天数（7天）；小鼠品系和性别（C57BL/6J，主要雄性）；DSS处理开始时间（第二次或第三次真菌给药后）。 阅读提示：Methods: DSS-induced colitis; Engyodontium culture and colonization; Figure 2 and 3 legends |
| 中性粒细胞相关实验 | 抗Ly6G单抗的剂量（100 μg/只）和给药频率（隔日一次，共5次）；CXCR1/2抑制剂reparixin的剂量（15 mg/kg）；TRAF6抑制剂C25-140的剂量和给药方式。 阅读提示：Methods: Flow cytometry; Figure 2 and Figure 4 legends |
| Treg分化实验 | naive CD4+ T细胞的分离方法（负选+CD62L磁珠）；Treg极化条件（TGF-β 5 ng/mL + IL-2）；L-谷氨酸的浓度（100-400 μg/mL）；培养时间（6天）。 阅读提示：Methods: Treg/Th1/Th17 cell in vitro differentiation |
| 人样本相关实验 | CD和UC患者的纳入标准；qPCR引物和探针序列；DL-glutamic acid定量方法；DECTIN-2、S100A8/9的免疫组化染色条件。 阅读提示：Methods: Human samples; RT-qPCR; IHC; Figure 7 legend |