抗体筛选与结构预测
筛选出功能性的OX40激动剂抗体并确定其结合表位。
通过噬菌体展示构建抗体库，筛选出HFB301001；利用AI结构预测（EnsembleFold）和HDX-MS验证其结合表位位于OX40的CRD1区域，且不干扰OX40L结合。
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HFB301001，一种基于OX40的免疫疗法，通过优化的OX40受体聚集驱动Treg清除和CTL激活
HFB301001, an OX40-based immunotherapy, drives Treg clearance and CTL activation through optimized OX40 receptor clustering
实验完整度
高包含体外细胞实验（报告细胞、共培养、受体聚集）、体内动物模型（MC38和E.G7肿瘤模型）、患者样本（肿瘤切片和淋巴结）、非人灵长类安全性研究、scRNA-seq等多层级验证。
主要模型
MC38小鼠结肠癌模型 E.G7小鼠淋巴瘤模型 hOX40人源化小鼠 Fcgr3基因敲除小鼠
重点核对
HFB301001与高亲和力突变体HFB301001hi的亲和力差异（KD=2.86×10-7 M vs 7.73×10-9 M） 抗体处理条件：MC38或E.G7肿瘤模型，荷瘤后肿瘤体积达50-100 mm3时腹腔注射10 mg/kg，每3天一次，共3次 Treg细胞清除实验：Fcgr3 KO小鼠，过继转移Treg细胞（1×10^5），HFB301001或HFB301001hi治疗（5 mg/kg） 肿瘤再挑战实验：HFB301001治愈的小鼠在初次清除后2个月再次接种MC38细胞（1×10^6）
摘要
背景
OX40是一个关键的共刺激受体，可增强T细胞介导的抗肿瘤免疫，是一个有前景的免疫治疗靶点。尽管大多数已进入临床试验的OX40激动剂具有高亲和力，但亲和力与激动活性之间的关系仍然复杂，需要进一步阐明亲和力对OX40免疫治疗疗效的影响及其潜在机制。
方法
我们通过噬菌体展示技术生成了不同亲和力的OX40激动剂抗体。使用基于AI的预测对抗体-受体相互作用进行建模，并通过氢氘交换进行验证。我们通过共聚焦显微镜和报告细胞实验评估了不同亲和力的OX40抗体对受体聚集、T细胞激活和调节性T细胞（Treg）耗竭的影响。我们进一步在多个小鼠肿瘤模型中评估了抗肿瘤疗效。使用单细胞RNA测序（scRNA-seq）、流式细胞术、ELISpot和免疫荧光研究了HFB301001治疗对肿瘤浸润T细胞的影响、在食蟹猴中的安全性以及临床样本中的免疫激活。
结果
我们鉴定了低亲和力OX40激动剂抗体HFB301001，并通过噬菌体展示技术生成了不同亲和力的变体。与其高亲和力突变体相比，HFB301001在体外诱导更强的受体聚集、增强T细胞激活，并介导更有效的自然杀伤细胞介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性以耗竭Treg。一致地，HFB301001通过增加瘤内T细胞浸润/激活和Treg清除而在体内优于高亲和力突变体。此外，HFB301001在食蟹猴中表现出良好的安全性，并在临床相关的肿瘤切片培养系统中有效激活肿瘤浸润T细胞。
结论
降低亲和力策略代表了OX40靶向癌症免疫疗法临床开发的一个有前景的框架。目前，HFB301001正在一项涉及晚期实体瘤患者的I期临床研究中结束（NCT05229601）。
关键词：免疫疗法，抗体，T细胞，调节性T细胞-Treg
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- OX40抗体亲和力对其抗肿瘤疗效的影响及其潜在机制。
- 核心机制
- 与高亲和力抗体相比，低亲和力OX40激动剂HFB301001通过增强OX40受体聚集，促进T细胞激活和NK细胞介导的ADCC清除Treg细胞，从而增强抗肿瘤免疫应答。
- 主要证据
- 体外实验显示HFB301001诱导更强的受体聚集、T细胞激活和Treg细胞毒性；体内实验显示HFB301001在MC38和E.G7肿瘤模型中抑制肿瘤生长，增加CD8+ T细胞浸润和激活，减少Treg；Fcgr3 KO实验证实ADCC介导的Treg清除是关键机制。
- 研究意义
- 该研究提出降低亲和力策略可优化OX40靶向免疫治疗，为下一代癌症免疫治疗提供新见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外功能验证
评估不同亲和力抗体对受体聚集、T细胞激活和Treg清除的影响。
利用OX40 NF-κB-Luc Jurkat报告细胞检测激活能力；用共聚焦显微镜观察OX40-GFP簇集；用FcγRIIIa NFAT-luc Jurkat报告细胞和NK细胞共培养评估ADCC作用。
体内疗效评估
比较不同亲和力抗体在体内抗肿瘤疗效及免疫应答。
在MC38和E.G7荷瘤模型中比较HFB301001和HFB301001hi的疗效，监测肿瘤体积、生存期和体重；通过流式细胞术分析肿瘤和淋巴结中的免疫细胞亚群。
Treg清除机制验证
验证ADCC介导的Treg清除对肿瘤抑制的作用。
利用Fcgr3 KO小鼠和Treg过继转移实验，比较HFB301001和HFB301001hi对肿瘤生长的影响，并评估不同Fc变体的疗效。
免疫记忆评估
评估HFB301001治疗是否建立长期免疫记忆。
对HFB301001治愈的MC38荷瘤小鼠进行肿瘤再挑战，观察肿瘤生长和生存情况；通过T细胞耗竭实验验证CD8+ T细胞的关键作用。
scRNA-seq分析
分析HFB301001治疗后肿瘤浸润T细胞的转录组变化。
对HFB301001或PBS处理的MC38肿瘤进行scRNA-seq，聚类分析T细胞亚群，比较差异基因表达和通路富集。
安全性与转化研究
评估HFB301001在非人灵长类中的安全性和在患者样本中的免疫激活。
在食蟹猴中进行单次静脉输注毒性研究，监测临床观察、体重、血液学、药代动力学和免疫表型；利用NSCLC患者来源的肿瘤和淋巴结样本检测OX40表达和HFB301001诱导的T细胞激活。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Pricella | PM150210 |
| RPMI-1640培养基 | Pricella | PM150110 | |
| 胎牛血清 | Pricella | 16421050 | |
| HEPES | Pricella | PB180325 | |
| 青霉素/链霉素 | Pricella | PB180120 | |
| NK细胞无血清培养基套装 | Yocon | NC0102.F | |
| 抗体筛选 | 生物素标记的人OX40蛋白 | ACRO Biosystems | TN4-H82E4 |
| 链霉亲和素磁珠Dynabeads M280 | Invitrogen | 11205D | |
| TIANprep质粒小提试剂盒 | TIANGEN | DP103-03 | |
| 结构预测 | EnsembleFold | -- | -- |
| HDX-MS | Q Exactive Plus四极杆-轨道阱质谱仪 | Thermo Scientific | -- |
| SPR | CM5传感芯片 | Cytiva | 10345041 |
| Biacore T200系统 | Cytiva | -- | |
| 小鼠抗人IgG Fc单克隆抗体 | Abcam | ab99757 | |
| 重组人OX40蛋白 | ACRO Biosystems | OX0-H5224 | |
| 氯化镁 | Cytiva | BR100839 | |
| 抗体激活实验 | 山羊抗人IgG-Fc二抗 | Sino Biological | SSA015 |
| D-荧光素钠盐 | Yeasen | 40901ES03 | |
| OKT3（抗CD3） | ACRO Biosystems | CDE-M120a | |
| 共培养实验 | 小鼠CD4+ CD25+调节性T细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-091-041 |
| CFSE | BioLegend | 423801 | |
| 7-AAD | BD Pharmingen | 559763 | |
| 荧光素酶检测系统 | Promega Corporation | G720A | |
| 动物实验 | Treg细胞分选试剂盒 | STEMCELL Technologies | 18783 |
| 抗CD4抗体 | Selleck | A2101 | |
| 抗CD8α抗体 | Bio X Cell | BE0004-1 | |
| 流式细胞术 | IV型胶原酶 | Solarbio | C8160 |
| 透明质酸酶 | Solarbio | H8030 | |
| DNase I | Solarbio | D8071 | |
| 红细胞裂解液 | Solarbio | R1010 | |
| 可固定活性染料 | BioLegend | 423106 | |
| 抗小鼠CD16/CD32抗体 | BioLegend | 101320 | |
| BD LSRFortessa X-20流式细胞仪 | BD | -- | |
| scRNA-seq | Chromium Next GEM单细胞5'试剂盒v2 | 10x Genomics | CG000330 |
| Illumina NovaSeq 6000测序平台 | Illumina | -- | |
| ELISpot | 抗IFN-γ捕获抗体 | Dakewe | 2210002 |
| 共聚焦显微镜 | 共聚焦培养皿 | NEST | 801001 |
| Hoechst核染色 | Solarbio | C0031 | |
| LEICA STELLARIS共聚焦显微镜 | Leica | -- | |
| 多重免疫荧光 | 抗CD4抗体 | Cell Signaling Technology | 25229T |
| 抗CD8抗体 | Cell Signaling Technology | 98941T | |
| 抗Foxp3抗体 | Cell Signaling Technology | 12653T | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| 抗淬灭封片剂（KGF028） | -- | KGF028 | |
| 流式细胞术结合实验 | Alexa Fluor 488山羊抗人IgG（H+L） | Invitrogen | A-11013 |
| 患者肿瘤切片培养 | 低熔点琼脂糖 | Solarbio | A8350 |
| 振动切片机（Leica VT1200S） | Leica | -- | |
| 含10%FBS的RPMI-1640培养基 | Gibco | A5669701 | |
| 动物实验 | hOX40人源化小鼠 | Shanghai Model Organisms Center | NM-HU-00041 |
| Fcgr3基因敲除小鼠 | Shanghai Model Organisms Center | NM-KO-190189 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 抗体亲和力测定 | SPR实验条件，包括抗体捕捉浓度、OX40蛋白浓度、流速、接触和解离时间；抗体KD值（HFB301001: 2.86×10^-7 M；HFB301001hi: 7.73×10^-9 M） 阅读提示：Methods: Surface plasmon resonance assays |
| 体外激活实验 | OX40 NF-κB-Luc Jurkat细胞处理条件，包括抗体浓度、是否加交联二抗（2.5 μg/mL）、孵育时间（5.5-6小时） 阅读提示：Methods: Antibody activation assay; Figure 2D |
| 受体聚集实验 | HEK293T-OX40-GFP细胞处理条件，包括抗体浓度（2 nM和10 nM）、二抗存在、孵育时间（12小时） 阅读提示：Methods: Confocal microscopy; Figure 2F |
| ADCC实验 | 共培养比例（E:T = 1:10或3:1）、孵育时间（24或48小时）、Treg细胞来源（hOX40小鼠脾脏）、效应细胞（FcγRIIIa NFAT-luc Jurkat或人NK细胞） 阅读提示：Methods: Co-culture assay; Figure 2G, 2H |
| 体内疗效实验 | 肿瘤细胞系（MC38或E.G7，1×10^6）、接种途径（皮下）、肿瘤体积达50-100 mm³后开始治疗、治疗剂量（10 mg/kg）、给药途径（腹腔）、给药频率（每3天一次，共3次） 阅读提示：Methods: Mouse experiments; Figure 3A |
| Treg清除机制实验 | Fcgr3 KO小鼠、Treg过继转移（1×10^5细胞，静脉）、治疗剂量（5 mg/kg）、给药时间（第6、9、12、15天） 阅读提示：Methods: Mouse experiments; Figure 6D |
| scRNA-seq | 肿瘤组织处理条件、单细胞文库制备试剂盒型号、测序平台；数据预处理参数（Seurat V5.0.1，PC=18，Wilcoxon检验） 阅读提示：Methods: scRNA-seq and analysis; Figure 5D |
| 安全性实验（食蟹猴） | 单次静脉输注剂量（1, 10, 100 mg/kg）、输注时长（1小时）、观察期（15天）、毒理学指标（临床观察、体重、血液学、免疫表型等） 阅读提示：Methods: Toxicity study in non-human primates |
| 患者样本实验 | NSCLC患者肿瘤和淋巴结来源、切片厚度（200 μm）、刺激条件（HFB301001 10 μg/mL，二抗和OKT3）、培养时间（未明确说明） 阅读提示：Methods: Patient-derived tumor tissue slices; Figure 7 |