单细胞和bulk转录组分析MCC肿瘤异质性
鉴定MCC肿瘤内的转录亚型并评估其与病毒状态及神经内分泌标志物表达的关系。
对9例患者肿瘤活检进行scRNA-seq（38,077个细胞），对44例肿瘤活检进行bulk RNA-seq，通过Seurat聚类和NMF分析鉴定转录亚型，并分析NE标志物与YAP1/WWTR1表达的负相关。
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YAP1和WWTR1表达与梅克尔细胞癌神经内分泌标志物呈负相关
YAP1 and WWTR1 expression inversely correlates with neuroendocrine markers in Merkel cell carcinoma
实验完整度
高包含单细胞和bulk RNA测序、免疫组化、免疫印迹、细胞活力实验、细胞周期分析及外源基因回补等体外功能验证和机制验证，证据层级丰富。
主要模型
患者来源的MCC肿瘤活检组织 MCPyV阳性MCC细胞系（MKL-1、WaGa） 患者来源的MCC细胞系（PDCLs）
重点核对
MCPyV状态（病毒阳性/阴性） NE标记物（ATOH1、SOX2等）与YAP1/WWTR1表达水平 YAP1/WWTR1诱导的TEAD结合能力 MCPyV LT表达水平 细胞周期（S期比例）和细胞活力
摘要
背景：梅克尔细胞癌（MCC）是一种侵袭性神经内分泌（NE）皮肤癌，由严重的紫外线诱导突变或梅克尔细胞多瘤病毒（MCPyV）大T和小T抗原（LT和ST）表达引起。尽管MCPyV阳性和阴性亚型之间存在深层遗传差异，但目前的临床诊断标志物无法区分它们，并且据我们所知，MCC肿瘤的表达谱尚未被探索。方法：在这里，我们利用患者来源肿瘤活检和细胞系的bulk和单细胞RNA-Seq来探索MCC潜在的转录环境。结果：令人惊讶的是，MCC样本可以被分为转录亚型，这些亚型与MCPyV状态无关。相反，我们观察到NE基因签名与Hippo通路转录因子Yes1相关转录调节因子（YAP1）和含WW结构域的转录调节因子1（WWTR1）之间存在负相关。这种负相关在肿瘤活检以及已建立和患者来源的细胞系中，在转录和蛋白质水平上广泛存在。机制上，在MCPyV阳性MCC细胞系中表达YAP1或WWTR1诱导细胞周期阻滞，至少部分通过TEA结构域依赖性（TEAD依赖性）转录抑制MCPyV LT。结论：这些发现确定了我们认为的MCC内NE基因表达中先前未被识别的异质性，并支持YAP1/WWTR1沉默对MCPyV阳性MCC的发展至关重要的模型。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- MCC肿瘤内是否存在独立于MCPyV状态的转录异质性，以及YAP1/WWTR1表达是否与神经内分泌标志物相关并影响MCC细胞生长。
- 核心机制
- YAP1或WWTR1通过TEAD依赖性转录抑制MCPyV LT，导致RB1依赖性G1/S细胞周期阻滞，从而抑制MCPyV阳性MCC细胞增殖。
- 主要证据
- 在MKL-1和WaGa细胞中诱导YAP1/WWTR1表达导致细胞活力下降和S期细胞减少；RNA-seq显示MCPyV LT下调；回补野生型LT可部分挽救增殖抑制，而RB1结合缺陷型LT无此效果。
- 研究意义
- 研究揭示了MCC内NE基因表达的异质性，支持YAP1/WWTR1沉默对MCPyV阳性MCC发展至关重要的模型，并提示该现象可能为泛神经内分泌癌的共同特征。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞系中验证YAP1/WWTR1与NE标志物的负相关
在细胞系水平验证YAP1/WWTR1与NE标志物表达的负相关关系。
通过RT-qPCR和免疫印迹检测PDCLs和已建立细胞系中YAP1、WWTR1及NE标志物表达，并观察细胞形态。
YAP1/WWTR1诱导实验评估对MCC细胞增殖的影响
确定YAP1或WWTR1表达对NEhi MCPyV阳性MCC细胞活力的影响及其是否依赖TEAD结合。
在MKL-1细胞中用多西环素诱导表达野生型或突变型YAP1/WWTR1，进行细胞活力测定（CellTiter-Glo）和细胞周期分析。
转录组分析鉴定YAP1/WWTR1下游靶基因
鉴定YAP1或WWTR1诱导后转录组变化，特别是MCPyV LT和细胞周期相关基因。
对诱导3天的MKL-1细胞进行bulk RNA-seq，使用DESeq2分析差异表达基因，并通过GO分析和LISA预测转录因子。
验证YAP1/WWTR1对MCPyV LT的调控及LT回补实验
验证YAP1/WWTR1是否通过抑制MCPyV LT导致细胞周期阻滞，以及LT是否为关键下游效应分子。
在MKL-1细胞中组成性表达野生型或RB1结合缺陷型LT（E216K），观察YAP1诱导后的细胞活力和细胞周期变化，并通过免疫印迹检测LT和CCN1水平。
生物信息学分析MCPyV基因组TEAD结合位点
确定YAP1/WWTR1是否直接结合MCPyV基因组调控LT表达。
检索MCPyV和SV40基因组的非编码调控区（NCCR）中的TEAD结合基序（5'-GGAATG-3'）。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | MilliporeSigma | -- | |
| GlutaMAX添加剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| DMEM培养基 | Gibco | -- | |
| Neurocult NS-A培养基 | STEMCELL Technologies | -- | |
| NS-A增殖添加剂 | STEMCELL Technologies | -- | |
| 成纤维细胞生长因子 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 表皮生长因子 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 肝素 | STEMCELL Technologies | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | -- | |
| IV型胶原酶 | MilliporeSigma | -- | |
| 透明质酸酶 | MilliporeSigma | -- | |
| Accutase消化液 | STEMCELL Technologies | -- | |
| 单细胞RNA测序 | 10x Genomics Chromium Next GEM单细胞5'试剂盒v2 | 10x Genomics | -- |
| Illumina NovaSeq S4测序平台 | Illumina | -- | |
| bulk RNA测序 | RNAlater RNA稳定液 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| TissueRuptor II匀浆器 | QIAGEN | -- | |
| AllPrep DNA/RNA迷你试剂盒 | QIAGEN | -- | |
| NEBNext Ultra II RNA文库制备试剂盒 | New England Biolabs | -- | |
| NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- | |
| 构建载体和病毒包装 | 聚乙烯亚胺 | -- | -- |
| 聚凝胺 | MilliporeSigma | -- | |
| 嘌呤霉素 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 杀稻瘟菌素 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 药物处理 | 多西环素 | MilliporeSigma | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| RNeasy试剂盒 | QIAGEN | -- | |
| RT-qPCR | High-Capacity cDNA逆转录试剂盒 | Applied Biosystems | -- |
| Brilliant III Ultra-Fast Sybr Green QPCR预混液 | Agilent Technologies | -- | |
| 细胞活力检测 | CellTiter-Glo细胞活力检测试剂盒 | Promega | -- |
| 细胞周期分析 | 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷 | Click Chemistry Tools | -- |
| Alexa Fluor 647叠氮化物 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 | MilliporeSigma | -- | |
| 免疫组织化学 | Leica Bond自动染色平台 | Leica | -- |
| Leica Biosystems Refine检测试剂盒 | Leica | -- | |
| 兔抗ATOH1抗体 | Proteintech | 21215-1-AP | |
| 小鼠抗YAP1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC101199 | |
| 兔抗TAZ抗体 | Cell Signaling Technology | 72804 | |
| 小鼠抗KRT20抗体 | DAKO | 72804 | |
| 免疫印迹 | RIPA裂解缓冲液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂 | -- | -- | |
| 磷酸酶抑制剂 | -- | -- | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| SuperSignal West Femto底物 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 兔抗YAP抗体 | Cell Signaling Technology | 14074 | |
| 兔抗YAP/TAZ抗体 | Cell Signaling Technology | 8418 | |
| 兔抗LATS1抗体 | Cell Signaling Technology | 3477 | |
| 兔抗LATS2抗体 | Cell Signaling Technology | 5888 | |
| 兔抗MST1抗体 | Cell Signaling Technology | 3682 | |
| 兔抗MST2抗体 | Cell Signaling Technology | 3952 | |
| 兔抗磷酸化MOB1（Thr35）抗体 | Cell Signaling Technology | 8699 | |
| 兔抗MOB1抗体 | Cell Signaling Technology | 13730 | |
| 兔抗TBP抗体 | Cell Signaling Technology | 8515 | |
| 小鼠抗Vinculin抗体 | MilliporeSigma | V9131 | |
| 兔抗ATOH1抗体 | Proteintech | 21215-1-AP | |
| 小鼠抗SOX2抗体 | R&D Systems | MAB2018 | |
| 兔抗CHGA抗体 | Cell Signaling Technology | 60893 | |
| 兔抗SYP抗体 | Cell Signaling Technology | 5461 | |
| 小鼠抗KRT20抗体 | Thermo Fisher Scientific | MS-377-S0 | |
| 小鼠Ab5抗体 | -- | -- | |
| 兔抗GFP抗体 | Cell Signaling Technology | 2956 | |
| 显微镜 | 尼康Eclipse TE300倒置显微镜 | Nikon | -- |
| Diagnostic Instruments 25.4 2百万像素滑轨相机 | Diagnostic Instruments | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 转录组分析 | 患者肿瘤活检的MCPyV状态、NE标志物表达水平、NMF分组（NEhi/NElo） 阅读提示：Results 部分及图2、图3，Supplemental Tables 1、4、5 |
| 细胞培养 | 细胞系名称（MKL-1、WaGa等）、培养基成分、血清浓度、生长因子浓度、培养条件 阅读提示：Methods 中 Tissue culture 部分 |
| YAP1/WWTR1诱导实验 | 诱导剂多西环素浓度（2 μg/mL）、处理时间（3或6天）、细胞系（MKL-1）、质粒构建（WT或突变体） 阅读提示：Methods 中 Generation of plasmid constructs 和 Viability assays 部分 |
| 细胞活力检测 | 检测试剂（CellTiter-Glo）、处理时间、读数方法、重复数（n=3） 阅读提示：Methods 中 Viability assays 部分 |
| 细胞周期分析 | EdU浓度（10 μM）、标记时间（1小时）、固定方法、DNA染色（DAPI）、流式细胞仪设置、事件数（至少30000） 阅读提示：Methods 中 Cell-cycle analysis 部分 |
| 免疫印迹 | 抗体（YAP、YAP/TAZ、LATS1、p-MOB1等）、稀释比例、裂解缓冲液（RIPA）、显影底物 阅读提示：Methods 中 Immunoblotting 部分 |
| 免疫组织化学 | 抗体（ATOH1、YAP1、TAZ、KRT20）、稀释比例、抗原修复条件 阅读提示：Methods 中 IHC 部分 |