CRISPR筛选鉴定ATXN3为PD-L1正向调控因子
系统鉴定调控PD-L1表达的去泛素化酶
构建靶向96个去泛素化酶基因的CRISPR敲除文库，感染B16细胞后分选PD-L1低表达和高表达群体，通过测序和MAGeCK分析，鉴定出ATXN3、USP30等候选基因。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
CRISPR筛选鉴定去泛素化酶ATXN3为PD-L1正向调控因子，促进肿瘤免疫逃逸
CRISPR screening identifies the deubiquitylase ATXN3 as a PD-L1-positive regulator for tumor immune evasion
实验完整度
高包含CRISPR筛选、体外细胞实验、蛋白质互作与泛素化分析、同系小鼠肿瘤模型、抗PD-1治疗实验及人组织芯片验证，涵盖体外、体内和临床样本多个证据层级。
主要模型
B16小鼠黑色素瘤细胞 LLC1小鼠肺癌细胞系 A549人肺腺癌细胞
重点核对
CRISPR筛选库包含96个去泛素化酶基因，感染B16细胞时MOI为0.3 IFN-γ处理浓度为10 ng/mL，处理24小时 缺氧条件为1% O2，处理48小时 PD-1抗体剂量为25、50、100 μg/只，腹腔注射
摘要
肿瘤PD-L1表达的调控对于加深我们对肿瘤免疫逃逸的理解和改善现有抗肿瘤免疫治疗至关重要。在此，我们描述了一个基于CRISPR的筛选平台，并鉴定出ATXN3是PD-L1转录的正向调控因子。TCGA数据库分析显示，在超过80%的人类癌症中，ATXN3与CD274呈正相关。ATXN3诱导的Pd-l1转录受到肿瘤微环境因素（包括炎症细胞因子IFN-γ和缺氧）的促进，通过保护其下游转录因子IRF1、STAT3和HIF-2α实现。此外，ATXN3作为AP-1转录因子JunB的去泛素化酶，表明ATXN3通过多种途径促进PD-L1表达。在癌细胞中靶向删除ATXN3很大程度上消除了IFN-γ和缺氧诱导的PD-L1表达，并因此在小鼠中增强了抗肿瘤免疫，这些效应部分被PD-L1重建所逆转。此外，肿瘤ATXN3抑制改善了检查点阻断抗肿瘤免疫治疗的临床前疗效。重要的是，ATXN3表达在人肺腺癌和黑色素瘤中升高，其水平与PD-L1及其转录因子IRF1和HIF-2α呈正相关。总之，我们的研究鉴定了一个先前未知的去泛素化酶ATXN3作为PD-L1转录的正向调控因子，并为靶向ATXN3以使检查点阻断抗肿瘤免疫治疗增敏提供了理论依据。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 哪些去泛素化酶调控肿瘤PD-L1表达，并如何影响肿瘤免疫逃逸？
- 核心机制
- ATXN3作为去泛素化酶，稳定PD-L1转录因子IRF1、STAT3、HIF-2α和JunB，从而在转录水平促进PD-L1表达。
- 主要证据
- CRISPR筛选鉴定ATXN3为PD-L1正向调控因子；体外实验证实ATXN3敲除降低PD-L1表达；免疫共沉淀和泛素化实验证实ATXN3与IRF1、STAT3、HIF-2α和JunB相互作用并抑制其泛素化；体内实验显示ATXN3敲除抑制肿瘤生长并增强CD8+ T细胞浸润和效应功能。
- 研究意义
- 靶向ATXN3可能增敏抗PD-1/PD-L1检查点阻断免疫治疗，为开发新的抗肿瘤免疫治疗策略提供理论依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证ATXN3对PD-L1表达的调控作用
验证ATXN3敲除或敲低对PD-L1表达的影响
在多种小鼠和人癌细胞中利用CRISPR或shRNA敲除/敲低ATXN3，通过Western blot、流式细胞术和RT-qPCR检测PD-L1蛋白和mRNA水平变化。
阐明ATXN3调控PD-L1的分子机制
确定ATXN3是否通过稳定转录因子促进PD-L1转录
通过免疫共沉淀检测ATXN3与IRF1、STAT3、HIF-2α、JunB的相互作用，用泛素化实验和放线菌酮追踪实验检测这些转录因子的泛素化水平和蛋白稳定性，并用荧光素酶报告基因实验验证ATXN3对CD274启动子活性的影响。
评估ATXN3抑制对体内抗肿瘤免疫的影响
验证ATXN3敲除是否能增强抗肿瘤免疫并抑制肿瘤生长
将LLC1和B16细胞（WT和ATXN3-KO）皮下接种C57BL/6小鼠，监测肿瘤生长，流式分析肿瘤浸润免疫细胞（CD4+、CD8+、Treg等）及其功能。
评估ATXN3抑制对检查点阻断治疗疗效的影响
测试ATXN3敲除是否增强抗PD-1抗体的抗肿瘤效果
对荷瘤小鼠用不同剂量抗PD-1抗体（25、50、100 μg/只）治疗，监测肿瘤生长和免疫细胞浸润。
人肿瘤组织验证ATXN3与PD-L1表达相关性
验证ATXN3与PD-L1表达在人类肿瘤中的相关性
通过免疫组化检测肺腺癌和黑色素瘤组织芯片中ATXN3、PD-L1、IRF1和HIF-2α的表达水平，并分析相关性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | ATCC | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | L3000150 |
| 细胞筛选 | 嘌呤霉素 | MedChemExpress | HY-B1743Aa |
| 细胞处理 | 干扰素-γ | PeproTech | AF-300-02 |
| CRISPR筛选 | lentiCRISPR v2载体 | -- | -- |
| BsmBI（快切酶） | Thermo Scientific | -- | |
| PureLink HiPure质粒小提试剂盒 | Invitrogen | K210003 | |
| 转染 | jetPRIME转染试剂 | Polyplus | 117-15 |
| 病毒滴度检测 | Lenti-X GoStix试剂盒 | Takara | 631280 |
| 流式分析 | 可固定活力染料eFluor 450 | eBioscience | 65-0863-14 |
| PD-L1-APC抗体 | BioLegend | 124312 | |
| PE偶联PD-L1抗体 | Invitrogen | 12598342 | |
| Accutase消化液 | Corning | 25-058-CI | |
| 膜联蛋白V结合缓冲液 | BioLegend | 42201 | |
| APC标记的膜联蛋白V | BioLegend | 640920 | |
| 碘化丙啶 | BioLegend | 79997 | |
| 免疫印迹 | ATXN3抗体 | Proteintech | 67057-1-Ig |
| HIF-2α抗体 | Abcam | ab207607 | |
| PD-L1抗体 | Abcam | ab213480 | |
| β-actin抗体 | Proteintech | 66009-1-Ig | |
| GAPDH抗体 | Proteintech | 10494-1-AP | |
| FLAG抗体 | MilliporeSigma | F1804 | |
| HA抗体 | Cell Signaling Technology | 3724S | |
| Myc抗体 | Cell Signaling Technology | 2278S | |
| IRF1抗体 | Cell Signaling Technology | 8478 | |
| STAT3抗体 | Cell Signaling Technology | 9139 | |
| STAT1抗体 | Cell Signaling Technology | 14994T | |
| JunB抗体 | Cell Signaling Technology | 3753 | |
| NF-κB（p65）抗体 | Cell Signaling Technology | 6956 | |
| c-Jun抗体 | Cell Signaling Technology | 9165 | |
| c-MYC抗体 | Cell Signaling Technology | 9402 | |
| 辣根过氧化物酶标记的二抗 | MilliporeSigma | 12-348 | |
| 增强化学发光底物 | Thermo Fisher Scientific | 34577 | |
| 蛋白G琼脂糖 | GE Healthcare | 17-0618-02 | |
| 荧光素酶报告基因实验 | 双荧光素酶报告基因试剂 | Promega | E2940 |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596018 |
| RNeasy微量提取试剂盒 | Qiagen | 74106 | |
| 逆转录 | qScript cDNA合成试剂盒 | Quanta Bioscience | 84003 |
| 实时定量PCR | qScript cDNA合成试剂盒 | Quanta Biosciences | 95047-100 |
| 免疫组化 | PD-L1抗体 | Cusabio | CSB-MA878942A1m |
| ATXN3抗体 | Proteintech | 13505-1-AP | |
| IRF1抗体 | Cell Signaling Technology | 847S | |
| HIF-2α抗体 | Thermo Fisher Scientific | PA1-16510 | |
| 动物实验 | 抗小鼠CD8抗体 | Bio X Cell | 53-6.72 |
| 大鼠IgG2a同型对照 | Bio X Cell | BE0089 | |
| 抗小鼠PD-1抗体 | Bio X Cell | BE0273 | |
| 组织处理 | 胶原酶IV | Worthington Biochemical | LS004188 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CRISPR筛选 | 感染B16细胞时的MOI、嘌呤霉素筛选浓度和时间 阅读提示：Methods: Development of deubiquitinase CRISPR screening |
| 细胞处理 | IFN-γ处理浓度和时间 阅读提示：Methods: Cell culture, transfection, generation of a stable cell line, and cell treatment |
| 缺氧实验 | 氧浓度和处理时间 阅读提示：Methods: Cell culture, transfection, generation of a stable cell line, and cell treatment |
| 体内肿瘤模型 | 细胞接种数量和注射方式 阅读提示：Methods: Animal studies |
| 检查点阻断治疗 | 抗PD-1抗体剂量和治疗时间 阅读提示：Methods: Animal studies |