建立Net39条件敲除小鼠模型
研究Net39在成年骨骼肌中的作用，避免全球敲除导致的幼年致死。
利用CRISPR/Cas9生成Net39 floxed等位基因，与HSA-CreERT2小鼠杂交，他莫昔芬诱导成年肌肉特异性敲除。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
Net39在Emery-Dreifuss肌营养不良症发病过程中保护肌核免受机械应力损伤
Net39 protects muscle nuclei from mechanical stress during the pathogenesis of Emery-Dreifuss muscular dystrophy
实验完整度
高包含体内条件敲除小鼠模型、体外细胞拉伸实验、转录组分析及AAV基因治疗验证，实验层级丰富，包含功能验证和机制验证。
主要模型
C2C12小鼠成肌细胞 Net39条件敲除小鼠 Lmna ΔK32小鼠模型 人类EDMD患者肌肉活检样本
重点核对
Net39条件敲除通过他莫昔芬诱导的Cre-loxP系统，在8周龄小鼠连续5天腹腔注射100 mg/kg他莫昔芬。 机械拉伸实验使用6孔静态细胞限制器（4Dcell CSOW 620）对C2C12成肌细胞施加1小时拉伸。 AAV9-Net39基因治疗通过面部静脉在P2天注射1×10^14 vg/kg剂量。 DNA损伤通过γH2A.X和TUNEL染色定量分析。
摘要
编码核膜蛋白的基因突变会导致称为核包膜病的疾病，其特征是骨骼肌和心脏异常，例如Emery-Dreifuss肌营养不良症（EDMD）。核膜在这些疾病病因中的组织特异性作用尚未被广泛探索。我们之前的研究表明，在小鼠中全球性敲除肌肉特异性核膜蛋白NET39会因骨骼肌功能障碍导致新生小鼠致死。为了研究Net39基因在成年期的潜在作用，我们生成了小鼠肌肉特异性条件敲除（cKO）Net39。cKO小鼠重现了EDMD的关键骨骼肌特征，包括肌肉萎缩、肌肉收缩功能受损、肌核形态异常和DNA损伤。Net39的缺失使成肌细胞对机械拉伸过度敏感，导致拉伸诱导的DNA损伤。Net39在先天性肌病的鼠标模型中下调，通过AAV基因递送恢复Net39表达延长了寿命并改善了肌肉异常。这些发现确定NET39是EDMD发病机制的直接贡献者，其作用是通过保护免受机械应激和DNA损伤。关键词：肌肉生物学；DNA修复，基因治疗。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 肌肉特异性核膜蛋白Net39在成年骨骼肌中的作用及其在EDMD发病中的机制是什么？
- 核心机制
- Net39缺失削弱肌核核膜完整性，导致肌核对机械应力敏感，引发DNA损伤，进而激活Mef2c依赖的病理基因表达程序。
- 主要证据
- Net39 cKO小鼠表现出肌肉萎缩、肌核变形及DNA损伤，体外拉伸实验显示shNet39成肌细胞DNA损伤加剧，Lmna ΔK32模型中AAV-Net39恢复Net39表达可减少DNA损伤并延长寿命。
- 研究意义
- 该研究确立了NET39作为EDMD发病的直接贡献者，并提示通过AAV递送恢复NET39表达可能为相关核包膜病提供治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
分析肌肉表型
评估Net39缺失对肌肉形态、功能和病理的影响。
通过H&E、WGA染色、肌纤维面积测量、握力测试和离体收缩力测定评估肌肉萎缩和功能障碍。
核膜完整性和DNA损伤检测
确定Net39缺失是否导致核膜异常和DNA损伤。
通过电子显微镜和SUN2免疫染色观察核形态，通过γH2A.X和TUNEL染色检测DNA损伤。
体外机械拉伸实验
验证Net39缺失是否增加肌核对机械应力的敏感性。
使用C2C12成肌细胞进行shRNA敲低Net39，利用细胞限制器施加拉伸，检测核变形和γH2A.X。
转录组分析
鉴定Net39缺失引起的基因表达变化。
进行bulk RNA-Seq和snRNA-Seq，分析差异表达基因和通路（如p53信号），并鉴定受影响的肌核亚群。
机制研究
揭示Net39调控Mef2c活性的机制。
通过ChIP-Seq、BioID、荧光素酶报告基因实验和DesMef-LacZ报告小鼠验证Net39对Mef2c的调控。
AAV基因治疗实验
检验恢复Net39表达是否能改善小鼠模型中的肌病表型。
将AAV9-CK8e-Net39或对照注射Net39-KO和Lmna ΔK32小鼠，分析肌肉表型、DNA损伤和生存率。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 基因敲除小鼠生成 | CRISPR/Cas9 | -- | -- |
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | Thermo Fisher | 26050088 |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Fisher | -- | |
| 嘌呤霉素 | Thermo Fisher | A1113803 | |
| 药物处理 | 紫杉醇 | Thermo Fisher | P3456 |
| 机械拉伸实验 | 6孔静态细胞限制器 | 4Dcell | CSOW 620 |
| 玻璃底6孔板 | MatTek Corp. | P06G-1.5-20-F | |
| 蛋白质分析 | RIPA裂解液 | MilliporeSigma | R0278 |
| PVDF膜 | Millipore | IPVH00010 | |
| 链霉亲和素磁珠 | Thermo Fisher | 88816 | |
| Laemmli上样缓冲液 | Bio-Rad | 1610737 | |
| GAPDH抗体 | MilliporeSigma | MAB374 | |
| α-微管蛋白抗体 | MilliporeSigma | T6199 | |
| NET39抗体 | MilliporeSigma | HPA070252 | |
| MEF2C抗体 | Cell Signaling Technology | 5030 | |
| MYOD抗体 | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-377460 | |
| MYOG抗体 | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-12732 X | |
| Vinculin抗体 | MilliporeSigma | V9131 | |
| HRP偶联链霉亲和素 | Thermo Fisher | N100 | |
| γH2A.X抗体 | MilliporeSigma | 05-636 | |
| 总ATM抗体 | Cell Signaling Technology | 2873T | |
| 磷酸化ATM（Ser1981）抗体 | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-47739 | |
| 组织学分析 | 麦胚凝集素染色 | Thermo Fisher | W11261 |
| Masson三色染色 | -- | -- | |
| NADH染色 | -- | -- | |
| 细胞色素c氧化酶染色 | -- | -- | |
| 琥珀酸脱氢酶染色 | -- | -- | |
| 异染性ATPase染色 | -- | -- | |
| 免疫荧光 | SUN2抗体 | MilliporeSigma | MABT880 |
| MYH7抗体 | DSHB | BA-D5 | |
| MYH2抗体 | DSHB | SC-71 | |
| MYH4抗体 | DSHB | BF-F3 | |
| MYH3抗体 | DSHB | F1.652-s | |
| γH2A.X抗体 | Cell Signaling Technology | 9718 | |
| CD11B抗体 | Abcam | ab133357 | |
| Desmin抗体 | Agilent | M076029-2 | |
| Cleaved caspase-3抗体 | Cell Signaling Technology | 9661 | |
| Laminin抗体 | MilliporeSigma | L9393 | |
| DAPI | MilliporeSigma | D9542 | |
| 凋亡检测 | Click-iT Plus TUNEL检测试剂盒 | Thermo Fisher | C10617 |
| RNA分析 | TRIzol | -- | -- |
| RNeasy Micro试剂盒 | QIAGEN | 74004 | |
| iScript逆转录酶 | Bio-Rad | 1708841 | |
| KiCqStart SYBR Green引物 | MilliporeSigma | -- | |
| RNA-seq | Chromium Next GEM单细胞3'基因表达试剂盒v3.1 | 10x Genomics | -- |
| Illumina NextSeq 500测序仪 | Illumina | -- | |
| ChIP-Seq | ChIP-IT高灵敏度试剂盒 | Active Motif | 53040 |
| Ty1抗体 | Diagenode | C15200054 | |
| 细胞转染 | FuGENE6转染试剂 | Promega | E2692 |
| 病毒包装 | pMD2.G质粒 | Addgene | 12259 |
| psPax2质粒 | Addgene | 12260 | |
| Retro-X浓缩液 | Takara | 631456 | |
| Lenti-X浓缩液 | Takara | 631232 | |
| 聚凝胺 | MilliporeSigma | TR-1003-G | |
| 靶向Net39的shRNA（pLKO） | MilliporeSigma | TRCN0000081368, TRCN0000081369, TRCN0000081370, TRCN0000081371, TRCN0000081372 | |
| 乱序shRNA | Addgene | 1864 | |
| BioID | 生物素 | MilliporeSigma | B4501 |
| 荧光素酶实验 | 荧光素酶检测系统 | Promega | E1500 |
| 哺乳动物β-半乳糖苷酶检测试剂盒 | Thermo Fisher | 75707 | |
| CLARIOstar酶标仪 | BMG Labtech | -- | |
| 蛋白质浓度测定 | BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher | 23225 |
| 电生理实验 | Grass Instruments FT03.C张力传感器 | Grass Instruments | -- |
| Powerlab 8/SP数据采集单元 | AD Instruments | -- | |
| 基因型分析 | GXL DNA聚合酶 | Takara | R050B |
| 单链寡核苷酸供体 | Integrated DNA Technologies | -- | |
| 药物处理 | 他莫昔芬 | Sigma-Aldrich | T5648 |
| 肌酸激酶检测 | VITROS化学产品CK载玻片 | VITROS | -- |
| VITROS 250化学系统 | VITROS | -- | |
| 电子显微镜 | JEOL JEM-1400 Plus透射电子显微镜 | JEOL | -- |
| RNA-seq分析 | Trimmomatic | -- | -- |
| HiSAT2 | -- | -- | |
| featureCounts | -- | -- | |
| DESeq2 | -- | -- | |
| snRNA-seq分析 | Cell Ranger | -- | -- |
| Seurat | -- | -- | |
| Scrublet | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 基因敲除小鼠诱导 | 他莫昔芬剂量、注射途径、注射时长、小鼠周龄 阅读提示：Methods: Conditional deletion of Net39 in adult mice |
| 组织学分析 | 肌肉固定、切片厚度、染色方法 阅读提示：Methods: Histological analyses |
| 核膜完整性和DNA损伤检测 | 抗体稀释度、孵育时间、显微镜设置 阅读提示：Methods: Histological analyses |
| 体外机械拉伸 | 细胞密度、拉伸时间、设备参数 阅读提示：Methods: In vitro studies |
| RNA-Seq | RNA提取方法、测序平台、分析参数 阅读提示：Methods: Gene expression analysis, Bulk RNA-Seq analysis, Analysis of single-nucleus RNA-Seq data sets |