构建突变受体细胞模型
在无内源性IR和IGF1R的DKO细胞中重建WT-IR或L973F-IR，以评价单氨基酸替换对信号的影响。
使用Cre-lox重组技术生成IR/IGF1R双敲除的棕色前脂肪细胞，并通过逆转录病毒感染稳定表达WT-IR或L973F-IR，验证受体表达水平。
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亮氨酸973是区分胰岛素和IGF-1受体信号传导的关键残基
Leucine-973 is a crucial residue differentiating insulin and IGF-1 receptor signaling
实验完整度
高包含体外细胞模型（DKO细胞重建WT-IR和L973F-IR）、体内敲入小鼠模型、磷酸化蛋白质组学分析及功能验证，证据层级多元。
主要模型
IR/IGF1R双敲除（DKO）棕色前脂肪细胞重建WT-IR或L973F-IR L973F-IR敲入小鼠 原代肝细胞
重点核对
L973F突变对IRS-1和Shc结合及下游信号通路的影响 L973F-IR小鼠的胰岛素敏感性、生长及高脂饮食反应 L973F突变对受体内化和葡萄糖摄取的影响
摘要
胰岛素和IGF-1受体（IR和IGF1R）高度同源，并共享相似的信号系统，但各自具有独特的生理作用，IR主要调节代谢稳态，而IGF1R调节促有丝分裂控制与生长。在这里，我们展示了在细胞内近膜区域NPEY基序远端的973位点，将单个氨基酸从亮氨酸（在IR中高度保守）替换为苯丙氨酸（在IGF1R中高度保守的同源残基），导致IRS-1/PI3K/Akt/mTORC1信号传导减少，而Shc/Gab1/MAPK细胞周期信号传导增加。因此，表达L973F-IR的细胞表现出胰岛素诱导的葡萄糖摄取减少、细胞生长增加和受体内化受损。携带L973F-IR敲入的小鼠在体内表现出类似的信号传导改变，这导致胰岛素敏感性降低、生长适度增加，以及在高脂饮食挑战时体重增加减少。因此，IR近膜区域的亮氨酸973是区分IR信号传导与IGF1R信号传导的关键残基。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- IR和IGF1R在近膜区域NPEY基序后第973位氨基酸的差异是否决定其特异性信号传导及生理功能？
- 核心机制
- IR第973位亮氨酸替换为苯丙氨酸导致IRS-1/PI3K/Akt/mTORC1信号减弱，Shc/Gab1/MAPK信号增强，使信号偏好从代谢转向促分裂，并降低受体内化。
- 主要证据
- 体外DKO细胞模型、敲入小鼠及原代肝细胞实验显示，L973F-IR降低IRS-1、Akt、mTOR磷酸化，增加Shc、ERK磷酸化，同时减少葡萄糖摄取、增加细胞增殖及生长，并损害受体内化。
- 研究意义
- 该研究阐明了IR和IGF1R信号差异的部分机制，为未来针对这些信号通路进行疾病治疗提供潜在见解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外信号通路分析
比较WT-IR与L973F-IR在胰岛素刺激下下游信号分子的磷酸化差异。
用不同浓度胰岛素刺激细胞，通过免疫印迹检测IR、IRS-1、Akt、mTOR、Shc、Gab-1、ERK等蛋白的磷酸化水平。
细胞功能分析
评估L973F-IR对胰岛素诱导的葡萄糖摄取、糖酵解、细胞增殖及受体内化的影响。
通过2-NBDG摄取实验、Seahorse分析、细胞计数及表面生物素化实验，比较WT-IR和L973F-IR细胞功能。
磷酸化蛋白质组学分析
全面鉴定WT-IR与L973F-IR在基础状态和配体刺激下的差异磷酸化位点及相关通路。
采用LC-MS/MS对WT-IR和L973F-IR细胞在基础状态及胰岛素或IGF-1刺激后进行磷酸化蛋白质组学分析，并进行PCA、热图及通路富集分析。
体内敲入小鼠模型分析
验证L973F-IR在体内的信号传导及生理表型影响。
通过CRISPR/Cas9构建L973F-IR敲入小鼠，分析其组织信号传导、代谢、生长及高脂饮食反应。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养与处理 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| pBabe逆转录病毒载体 | -- | -- | |
| 药物处理 | 胰岛素 | MilliporeSigma | -- |
| 胰岛素样生长因子1 | PeproTech | -- | |
| 基因编辑 | CRISPR RNA | IDT | -- |
| 反式激活CRISPR RNA | IDT | -- | |
| Cas9蛋白 | IDT | -- | |
| 单链DNA修复模板 | IDT | -- | |
| RNA提取与qPCR | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-Rad | -- | |
| C1000热循环仪 | Bio-Rad | CFX384 | |
| 蛋白提取与定量 | RIPA裂解液 | MilliporeSigma | -- |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 | BioTools | -- | |
| Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 免疫印迹 | PVDF膜 | -- | -- |
| Starting Block T20封闭液 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 辣根过氧化物酶标记二抗 | MilliporeSigma, Bio-Rad | -- | |
| 化学发光HRP底物 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| IRβ抗体 (sc-711) | Santa Cruz Biotechnology Inc. | sc-711 | |
| p-IRβ/IGF1Rβ抗体 (货号3024) | Cell Signaling Technology | 3024 | |
| IRβ抗体 (货号3025) | Cell Signaling Technology | 3025 | |
| IGF1Rβ抗体 (货号3027) | Cell Signaling Technology | 3027 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 4970 | |
| GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 5174 | |
| p-AKTS473抗体 | Cell Signaling Technology | 4060 | |
| AKT泛抗体 | Cell Signaling Technology | 4685 | |
| p-ERK1/2T202/Y204抗体 | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 9102 | |
| p-ShcY239/240抗体 | Cell Signaling Technology | 2434 | |
| Shc抗体 | Cell Signaling Technology | 2432 | |
| p-Gab-1Y627抗体 | Cell Signaling Technology | 3233 | |
| Gab-1抗体 | Cell Signaling Technology | 3232 | |
| p-mTORS2481抗体 | Cell Signaling Technology | 2974 | |
| mTOR抗体 | Cell Signaling Technology | 2972 | |
| p-c-JunS73抗体 | Cell Signaling Technology | 3270 | |
| c-Jun抗体 | Cell Signaling Technology | 9165 | |
| p-S6S235/236抗体 | Cell Signaling Technology | 2211 | |
| S6抗体 | Cell Signaling Technology | 2217 | |
| p-JNKT183/Y185抗体 | Cell Signaling Technology | 4668 | |
| JNK抗体 | Cell Signaling Technology | 9252 | |
| p-IRS-1 Y608抗体 | MilliporeSigma | 09-432 | |
| IRS-1抗体 | MilliporeSigma | 06-248 | |
| Vinculin抗体 | MilliporeSigma | MAB3574 | |
| 羊抗鼠HRP标记二抗 | MilliporeSigma | NA931 | |
| 羊抗兔HRP标记二抗 | Bio-Rad | 1706515 | |
| 糖酵解测量 | Seahorse XFe96生物分析仪 | Agilent Technologies | -- |
| XF糖酵解压力测试试剂盒 | Agilent Technologies | -- | |
| 葡萄糖摄取测量 | 2-NBDG荧光葡萄糖类似物 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 脂质测量 | 总胆固醇检测试剂盒 | Cell Biolabs Inc. | STA-384 |
| 甘油三酯比色检测试剂盒 | Cayman | 10010303 | |
| 受体内化实验 | EZ-Link Sulfo-NHS-LC-生物素 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Pierce链霉亲和素琼脂糖树脂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 分化诱导 | 吲哚美辛 | -- | -- |
| 地塞米松 | -- | -- | |
| IBMX | -- | -- | |
| 三碘甲状腺原氨酸 | -- | -- | |
| 动物实验 | 小鼠饲料9F | PharmaServ | -- |
| 高脂饮食D-12492 | Research Diets | D-12492 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞模型构建 | IR/IGF1R DKO前脂肪细胞来源；WT-IR和L973F-IR的逆转录病毒表达载体信息 阅读提示：Methods: Brown preadipocyte isolation, retroviral infection, and culture |
| 体外信号通路分析 | 胰岛素刺激浓度（0-100 nM）及时间（15分钟）；细胞血清饥饿条件（6小时，0.1% BSA） 阅读提示：Methods: Insulin signaling; Figure 1F and G |
| 体内信号通路分析 | L973F-IR敲入小鼠品系（C57BL/6N）；胰岛素注射剂量（2 U）及时间（10分钟）；组织类型（骨骼肌、肝脏、WAT） 阅读提示：Figure 6E and F; Supplemental Figure 7 and 8 |
| 代谢表型分析 | 高脂饮食持续时间及脂肪含量（60%）；IPGTT和ITT的剂量（葡萄糖2 g/kg, 胰岛素1 U/kg等）及禁食时间 阅读提示：Methods: CRISPR-mediated generation of a knockin mouse; Figure 8 |