验证RBP-J在结肠巨噬细胞中的敲除效率
确认RBP-J在结肠巨噬细胞中特异性缺失，排除发育或稳态异常的影响
通过qPCR和免疫印迹检测分选的LP CD64+Ly6C−结肠巨噬细胞中RBP-J表达，并比较稳态下WT和RBP-J KO小鼠结肠结构、巨噬细胞数量和微生物组成
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结肠巨噬细胞转录因子RBP-J协调针对细菌病原体的肠道免疫
The colonic macrophage transcription factor RBP-J orchestrates intestinal immunity against bacterial pathogens
实验完整度
高包含遗传小鼠模型（RBP-J KO、miR-17∼92 KO、DKO）进行体内功能验证，体外巨噬细胞-T细胞共培养和机制研究，以及小RNA测序等组学分析，多个证据层级验证。
主要模型
小鼠柠檬酸杆菌感染模型 RBP-J条件性敲除小鼠（Rbpjfl/fl Lyz2-Cre） miR-17∼92条件性敲除小鼠（miR-17∼92fl/fl Lyz2-Cre）
重点核对
RBP-J敲除效率验证：qPCR和免疫印迹检测分选结肠巨噬细胞中RBP-J表达 C. rodentium感染剂量：2×10^9或4×10^9 CFU口服灌胃 IL-6补充实验：感染后第3天和第5天腹腔注射200 ng重组IL-6 新霉素清除病原体实验：感染后第12天口服1 mg/ml新霉素硫酸盐
摘要
巨噬细胞在维持肠道免疫耐受和炎症反应之间的平衡中发挥多效性作用。在此，我们确定转录因子RBP-J是结肠巨噬细胞介导的针对肠道病原体柠檬酸杆菌免疫反应的关键调节因子。在免疫反应阶段，RBP-J通过维持C/EBPβ依赖性IL-6产生，克服miRNA-17∼92介导的抑制作用，从而增强肠道巨噬细胞引发的Th17细胞免疫反应，促进病原体清除。RBP-J缺陷相关的表型可以通过在巨噬细胞中进一步删除miRNA-17∼92而在遗传上得到纠正。在晚期阶段，RBP-J KO小鼠中未清除的病原体招募了大量表达IL-1β的CD64+Ly6C+结肠巨噬细胞，从而促进ILC3来源的IL-22持续产生，以补偿受损的先天性和适应性免疫反应，最终清除病原体。这些结果表明，结肠巨噬细胞固有的RBP-J通过与T细胞和固有淋巴样细胞谱系的关键免疫细胞相互作用，动态协调针对病原体感染的肠道免疫。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 结肠巨噬细胞中的转录因子RBP-J如何调控针对肠道病原体柠檬酸杆菌的免疫反应？
- 核心机制
- RBP-J通过抑制miR-17∼92簇，上调C/EBPβ表达，促进巨噬细胞产生IL-6，进而支持Th17细胞免疫反应；在晚期，未清除的病原体招募CD64+Ly6C+巨噬细胞产生IL-1β，激活ILC3产生IL-22，诱导抗菌肽清除病原体。
- 主要证据
- RBP-J KO小鼠在感染后第12-15天细菌负荷升高，IL-17A产生减少；IL-6表达降低；进一步删除miR-17∼92可恢复表型；晚期IL-22和抗菌肽表达升高，依赖ILC3，且新霉素清除病原体后下降。
- 研究意义
- 揭示结肠巨噬细胞RBP-J在感染不同阶段动态协调T细胞和ILC反应，为理解肠道免疫调节及感染性结肠炎发病机制提供新视角。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
感染模型及细菌负荷监测
评估RBP-J缺陷对宿主清除C. rodentium能力的影响
小鼠经口灌胃感染C. rodentium，在不同时间点收集结肠和粪便，通过qPCR检测16S rDNA拷贝数监测细菌负荷
免疫反应阶段细胞和分子分析
确定RBP-J缺陷影响适应性免疫反应的细胞类型和关键分子
在感染后第7天，通过qPCR和流式细胞术检测结肠组织和LP中细胞因子表达、Th17细胞比例、中性粒细胞招募、ILC3和抗体反应
机制研究：RBP-J调节IL-6和miR-17∼92-C/EBPβ轴
阐明RBP-J促进IL-6产生的分子机制
通过ChIP、小RNA测序、qPCR、Western blot、荧光素酶报告基因和siRNA敲减实验，验证RBP-J抑制miR-17∼92簇进而上调C/EBPβ，从而促进IL-6表达
遗传回补实验：DKO小鼠
验证miR-17∼92簇是RBP-J的关键下游靶点
构建Rbpj和miR-17∼92双敲除小鼠，感染后评估细菌负荷、IL-6和IL-17A表达、Th17细胞和中性粒细胞反应
晚期感染阶段ILC3-IL-22-AMP轴分析
探索RBP-J KO小鼠最终清除病原体的补偿机制
在感染后第12-14天，检测结肠IL-22和抗菌肽表达，通过免疫荧光和流式细胞术鉴定IL-22来源细胞，并用新霉素清除病原体验证因果关系
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细菌培养 | 柠檬酸杆菌DBS100菌株 | American Type Culture Collection | ATCC51459 |
| 表达GFP的柠檬酸杆菌 | -- | -- | |
| 细胞刺激 | 脂多糖（E. coli O111:B4） | Sigma-Aldrich | -- |
| 抗生素处理 | 硫酸新霉素 | Sigma-Aldrich | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| HEK293T细胞 | -- | -- | |
| 细胞刺激 | 佛波酯 | Sigma-Aldrich | -- |
| 离子霉素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 细胞因子ELISA | 白细胞介素-6 | Peprotech | -- |
| 白细胞介素-1β | BD Biosciences | -- | |
| ELISA | SBA Clonotyping系统 | Southern Biotech | -- |
| qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| M-MLV逆转录酶 | Takara | -- | |
| FastSYBR混合物 | CWBIO | -- | |
| TaqMan microRNA逆转录试剂盒 | Applied Biosystems | -- | |
| TaqMan microRNA检测 | Applied Biosystems | -- | |
| ChIP | SimpleChIP酶法ChIP试剂盒 | Cell Signaling Technology | -- |
| RBP-J抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| Western blot | 抗C/EBPβ抗体 | Abcam | ab32358 |
| β-肌动蛋白抗体 | ABclonal Technology | ac026 | |
| 磷酸化p44/42 MAPK（Erk1/2）兔单抗 | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| 磷酸化p38 MAPK兔单抗 | Cell Signaling Technology | 9215 | |
| 磷酸化NF-κB p65兔单抗 | Cell Signaling Technology | 3033 | |
| RBP-J兔单抗 | Cell Signaling Technology | 5313 | |
| STAT3小鼠单抗 | Cell Signaling Technology | 9139 | |
| 羊抗兔IgG（H&L）-HRP偶联抗体 | EASYBIO | BE0101 | |
| 羊抗小鼠IgG抗体 | EASYBIO | BE0102 | |
| SuperSignal West Pico化学发光底物 | Thermo Scientific | 34080 | |
| 荧光素酶报告基因 | psiCHECK2载体 | Promega | -- |
| pCMV-miR-17∼92表达质粒 | -- | -- | |
| FuGENE HD转染试剂 | Promega | -- | |
| 双荧光素酶报告检测系统 | Promega | -- | |
| RNA干扰 | 靶向小鼠Cebpb的siRNA | GenePharma | -- |
| INVI DNA RNA转染试剂 | Invigentech | -- | |
| 流式细胞术 | 抗CD45抗体 | BioLegend | -- |
| 抗I-Ab抗体 | BioLegend | -- | |
| 抗Ly6C抗体 | BioLegend | -- | |
| 抗CD64抗体 | BioLegend | -- | |
| 抗CD103抗体 | BioLegend | -- | |
| 抗CX3CR1抗体 | BioLegend | -- | |
| 抗CD4抗体 | BioLegend | -- | |
| 抗CD44抗体 | BioLegend | -- | |
| 抗CD62L抗体 | BioLegend | -- | |
| 抗CD69抗体 | BioLegend | -- | |
| 抗CD90.2抗体 | BioLegend | -- | |
| 抗CD11b抗体 | eBioscience | -- | |
| 抗CD11c抗体 | eBioscience | -- | |
| 抗F4/80抗体 | eBioscience | -- | |
| 抗CD3抗体 | eBioscience | -- | |
| 抗IL-17a抗体 | eBioscience | -- | |
| 抗IL-22抗体 | eBioscience | -- | |
| 抗Foxp3抗体 | eBioscience | -- | |
| 抗RORγt抗体 | eBioscience | -- | |
| 抗STAT3抗体 | eBioscience | -- | |
| 抗SiglecF抗体 | BD Biosciences | -- | |
| 抗Ly6G抗体 | BD Biosciences | -- | |
| 抗CD25抗体 | BD Biosciences | -- | |
| 同型对照抗体 | BioLegend | -- | |
| 可固定活力染料eFluor 506 | eBioscience | -- | |
| 固定和透化试剂盒 | BD Biosciences | -- | |
| Foxp3/转录因子染色缓冲液套装 | eBioscience | -- | |
| 抗C/EBPβ抗体 | Abcam | ab32358 | |
| 兔IgG同型对照 | Abcam | ab172730 | |
| 驴抗兔IgG-FITC | Santa Cruz | sc-2090 | |
| FACSFortessa流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| FACSAria III流式细胞分选仪 | BD Biosciences | -- | |
| FlowJo软件 | Tree Star | -- | |
| 免疫组织化学 | 抗Reg3g抗体 | Abgent | AP5606c |
| 免疫荧光 | OCT包埋剂4583 | Sakura Finetek | -- |
| 抗绿色荧光蛋白抗体 | Invitrogen | A11122 | |
| IL-22抗体 | Novus | NB100-737 | |
| 羊抗兔IgG-TR | Santa Cruz | sc-2780 | |
| DAPI | -- | -- | |
| SlowFade Diamond抗淬灭封片剂 | Life Technologies | -- | |
| 细胞分离 | IV型胶原酶 | Sigma-Aldrich | -- |
| 分散酶 | Roche | -- | |
| 脱氧核糖核酸酶I | Sigma-Aldrich | -- | |
| Percoll分离液 | GE Healthcare | -- | |
| Hank's平衡盐溶液 | -- | -- | |
| HEPES | -- | -- | |
| EDTA | Promega | -- | |
| 二硫苏糖醇 | Fermentas | -- | |
| RPMI 1640培养基 | -- | -- | |
| 细胞分选 | CD4（L3T4）MACS分选柱 | Miltenyi Biotech | -- |
| 体外T细胞分化 | 抗CD3抗体 | Sungene | -- |
| 抗CD28抗体 | Sungene | -- | |
| 重组人转化生长因子-β | R&D Systems | -- | |
| 白细胞介素-6 | Peprotech | -- | |
| 小RNA测序 | mirVana miRNA分离试剂盒 | Life Technologies | -- |
| Illumina TruSeq小RNA文库制备试剂盒 | Illumina | -- | |
| Illumina HiSeq 1500测序平台 | Illumina | -- | |
| 数据分析 | Prism 6.0统计软件 | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠模型 | 条件性敲除小鼠品系（Rbpjfl/fl Lyz2-Cre等），年龄6-8周，性别匹配，C57/BL6背景，SPF环境 阅读提示：Materials and methods: Mice |
| 感染实验 | C. rodentium菌株（DBS100或GFP标记），感染剂量2×10^9或4×10^9 CFU，口服灌胃体积200 µl 阅读提示：Materials and methods: C. rodentium infection and depletion; Figure legends |
| 免疫反应分析 | 检测时间点（第7天免疫反应，第14天晚期），组织处理和LP细胞分离方法，流式抗体克隆号和稀释度 阅读提示：Materials and methods: Preparation of colonic LP mononuclear cells, Flow cytometry |
| 机制验证 | BMDM培养条件（L929上清），刺激物（热灭活C. rodentium MOI=0.5或LPS 10 ng/ml），siRNA敲减Cebpb，荧光素酶报告质粒构建设计 阅读提示：Materials and methods: Cell isolation, RNA-mediated interference, Luciferase reporter assays |
| 体内回补实验 | 重组IL-6腹腔注射剂量（200 ng/只），时间（第3和5天），新霉素清除剂量（1 mg/ml，250 µl）和时间（第12天） 阅读提示：Materials and methods: IL-6 administration in vivo, C. rodentium infection and depletion |