动物模型建立与药物干预
评估THBru对动脉粥样硬化小鼠的治疗效果
8周龄雄性ApoE−/−小鼠分为ND、HFD、THBru低剂量、THBru高剂量和ATO组，HFD喂养16周，同时每天灌胃给予THBru或ATO，观察主动脉形态、病理染色和血脂水平。
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THBru通过调控超级增强子相关ABCC1抑制内皮细胞铁死亡从而改善动脉粥样硬化
THBru ameliorates atherosclerosis by inhibiting endothelial ferroptosis via regulation of the super-enhancer-associated ABCC1
实验完整度
高包含细胞模型（HUVECs）和动物模型（ApoE−/−小鼠）两个独立证据层级，并进行功能验证（铁死亡指标）和机制验证（转录因子、信号通路）。
主要模型
人脐静脉内皮细胞（HUVECs） ox-LDL诱导的内皮损伤细胞模型 ApoE−/−小鼠高脂饮食诱导的动脉粥样硬化模型 人下肢动脉样本
重点核对
ApoE−/−小鼠模型：8周龄雄性，高脂饮食16周，THBru灌胃剂量25和50 mg/kg，ATO 5 mg/kg HUVECs：50 μg/mL ox-LDL处理24小时，THBru浓度20和40 μmol/L AMPK抑制剂Compound C处理浓度10 μmol/L BACH1过表达质粒转染浓度2.5 mg/L SE抑制剂JQ1处理浓度500 nmol/L
摘要
动脉粥样硬化是一种与内皮功能障碍密切相关的慢性血管疾病。铁死亡是内皮功能障碍的主要因素，在动脉粥样硬化的进展中发挥关键作用。开发靶向内皮铁死亡的药物为动脉粥样硬化提供了潜在的治疗方法。本研究旨在评估四氢小檗碱（THBru）对动脉粥样硬化的潜在影响，并阐明其内皮保护作用的分子机制。我们的结果表明，THBru显著减少动脉粥样硬化小鼠主动脉中的斑块形成。通过转录组测序及进一步验证，我们观察到THBru通过增强谷胱甘肽稳态和减少活性氧（ROS）积累来减轻动脉粥样硬化中的内皮铁死亡。机制上，生物信息学分析表明，THBru降低了超级增强子（SE）调控基因ATP结合盒亚家族C成员1（ABCC1）的表达。转录因子BTB和CNC同源蛋白1（BACH1）通过结合其超级增强子（ABCC1-SE）负责ABCC1的转录，而THBru有效抑制了ABCC1-SE的活性。此外，THBru促进单磷酸腺苷激活蛋白激酶（AMPK）激活，从而负调控BACH1及其下游ABCC1/铁死亡信号通路。总之，这些发现凸显了THBru作为治疗动脉粥样硬化的有前景的候选药物，其新机制通过AMPK/BACH1轴调节ABCC1-SE抑制内皮铁死亡。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- THBru是否通过调控超级增强子相关ABCC1抑制内皮细胞铁死亡从而改善动脉粥样硬化？
- 核心机制
- THBru通过激活AMPK，负调控BACH1，进而抑制ABCC1-SE活性，减少ABCC1转录，增强谷胱甘肽稳态，减少ROS积累，抑制内皮细胞铁死亡，延缓动脉粥样硬化进展。
- 主要证据
- 在ApoE−/−小鼠模型中，THBru减少斑块形成、脂质沉积和铁死亡指标（4-HNE、MDA、Fe2+）；在HUVECs中，THBru抑制ox-LDL诱导的铁死亡，包括降低ROS、Fe2+和脂质过氧化物，恢复铁死亡相关蛋白表达。通过双荧光素酶报告基因实验证实BACH1结合ABCC1-SE，THBru抑制其转录活性。AMPK抑制剂Compound C逆转THBru的保护作用。
- 研究意义
- THBru作为治疗动脉粥样硬化的潜在候选药物，通过AMPK/BACH1/ABCC1轴调节ABCC1-SE抑制内皮铁死亡，为靶向SE的治疗策略提供新见解，加速基于THBru的心血管疾病干预的临床转化。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞模型建立与药物干预
验证THBru对ox-LDL诱导的内皮细胞损伤的保护作用及铁死亡抑制
HUVECs用ox-LDL处理建立模型，与THBru共处理，检测细胞活力、ROS、Fe2+、脂质过氧化物、谷胱甘肽代谢和铁死亡相关蛋白表达。
转录组测序及差异基因分析
识别THBru影响的关键通路和靶基因
对ox-LDL处理及THBru处理的HUVECs进行RNA-seq，进行KEGG和GSEA分析，发现AMPK信号通路和铁死亡相关通路富集。
超级增强子鉴定及靶基因关联
发现与内皮铁死亡相关的超级增强子及其靶基因
利用GEO数据库中H3K27ac ChIP-seq数据分析ox-PAPC处理的HAECs中的SE，与RNA-seq差异基因及铁死亡基因取交集，筛选出ABCC1。
验证ABCC1在动脉粥样硬化中的表达
确证ABCC1在动脉粥样硬化内皮细胞中上调以及THBru的抑制作用
在人动脉样本、动脉粥样硬化小鼠主动脉根部和ox-LDL处理的HUVECs中检测ABCC1表达，并用JQ1验证SE抑制剂的作用。
转录因子鉴定及ABCC1-SE调节机制
确定调控ABCC1-SE的转录因子并验证THBru的作用
利用FIMO数据库预测BACH1，双荧光素酶报告基因实验验证BACH1与ABCC1-SE结合，过表达BACH1考察对ABCC1及铁死亡的影响。
AMPK信号通路验证
阐明THBru通过AMPK/BACH1轴抑制铁死亡的机制
检测AMPK磷酸化水平，使用AMPK抑制剂Compound C和siRNA敲低，以及AMPK激动剂AICAR处理，观察对BACH1/ABCC1/铁死亡的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
验证铁死亡
验证机制链路
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | ApoE−/−小鼠 | Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | Strain |
| 羧甲基纤维素钠 | MedChemExpress | -- | |
| 三溴乙醇 | Meilunbio | -- | |
| 血脂检测 | 总胆固醇检测试剂盒 | Jiancheng Biological Engineering Institute | -- |
| 甘油三酯检测试剂盒 | Jiancheng Biological Engineering Institute | -- | |
| 高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒 | Jiancheng Biological Engineering Institute | -- | |
| 低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒 | Jiancheng Biological Engineering Institute | -- | |
| 日立7100全自动生化分析仪 | Hitachi | -- | |
| 铁离子检测 | FerroOrange荧光探针 | DOJINDO Laboratories | -- |
| 总铁比色检测试剂盒 | Elabscience | -- | |
| 病理染色 | 油红O染色试剂盒 | Solarbio | -- |
| Masson染色试剂盒 | Solarbio | -- | |
| 免疫组化 | 4-羟基壬烯醛抗体 | MedChemExpress | -- |
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素-庆大霉素溶液 | BioSharp | -- | |
| 胰蛋白酶（0.25%） | BioSharp | -- | |
| 氧化低密度脂蛋白 | Peking Union-Biology | -- | |
| 二甲基亚砜 | BioSharp | -- | |
| 药物处理 | JQ1 | MedChemExpress | -- |
| 化合物C | Selleckchem | -- | |
| 细胞转染 | SuperKine™ Lipo3.0转染试剂 | Abbkine | -- |
| 细胞活力检测 | 细胞计数试剂盒-8 | MedChemExpress | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | -- | |
| 硝酸纤维素膜 | Pall Corporation | -- | |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| 含Tween-20的Tris缓冲盐溶液 | BioSharp | -- | |
| ACSL4抗体 | Abcam | ab155282 | |
| COX2抗体 | CST | 12282 | |
| GPX4抗体 | Abcam | ab125066 | |
| XCT抗体 | Abcam | ab307601 | |
| FTH1抗体 | CST | 4393 | |
| ABCC1抗体 | CST | 14685S | |
| BACH1抗体 | Proteintech | 14018-1-AP | |
| AMPK抗体 | CST | 2532 | |
| 磷酸化AMPKα (Thr172)抗体 | CST | 2535 | |
| GAPDH抗体 | MedChemExpress | YA874 | |
| 二抗 | Abbkine | -- | |
| Odyssey红外成像系统 | Li-COR Biosciences | -- | |
| 氧化应激检测 | 活性氧检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| 2',7'-二氯二氢荧光素二乙酸酯 | -- | -- | |
| 脂质过氧化检测 | C11 BODIPY 581/591荧光探针 | MCE | -- |
| MDA检测 | 丙二醛检测试剂盒 | Jiancheng Biological | -- |
| 免疫荧光 | Triton X-100 | Beyotime | -- |
| CD31抗体 | R&D Systems | AF3628 | |
| DAPI | -- | -- | |
| RNA-seq | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| Bioanalyzer 2100分析仪 | Agilent Technologies | -- | |
| RNA 6000 Nano LabChip试剂盒 | Agilent Technologies | -- | |
| Illumina NovaSeq™ 6000测序平台 | Illumina | -- | |
| 双荧光素酶报告基因 | 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | -- |
| qRT-PCR | NanoDrop ND-8000分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 逆转录试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| SYBR Green荧光染料 | Roche | -- | |
| 罗氏LightCycler 96实时荧光定量PCR仪 | Roche | -- | |
| 显微镜 | 荧光显微镜 | Olympus | -- |
| 共聚焦显微镜 | Carl Zeiss Microscopy | -- | |
| 病理切片 | 冷冻切片机 | Leica | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物实验 | 模型：8周龄雄性ApoE−/−小鼠，高脂饮食16周；给药：THBru 25和50 mg/kg，ATO 5 mg/kg，灌胃每日一次；对照：ND和HFD组，ND组正常饮食，HFD组高脂饮食，均不给药但给予CMC-Na。 阅读提示：Methods 2.2 Animals and models construction |
| 细胞实验 | 细胞：HUVECs (来源Meisen)，培养条件RPMI 1640+15%FBS+1%抗生素；模型：ox-LDL 50 μg/mL处理24h；THBru浓度20和40 μmol/L；对照：0.1% DMSO。 阅读提示：Methods 2.7 Cell culture and treatment |
| 铁死亡检测 | ROS检测：DCFH-DA浓度5 mmol/L，37°C孵育20min；FerroOrange浓度1 μmol/L，孵育30min；脂质过氧化：C11 BODIPY 581/591浓度5 mmol/L，孵育30min。 阅读提示：Methods 2.11 Oxidative stress assays; 2.5 Determination of Fe2+ content |
| Western blot | 蛋白上样量70 μg；一抗浓度及孵育条件：ACSL4 1:2000, 4°C 10h；COX2 1:1000；GPX4 1:2000；XCT 1:1000；FTH1 1:1000；ABCC1 1:1000；BACH1 1:2000；AMPK 1:500；p-AMPK 1:500；GAPDH 1:2000；二抗1:5000。 阅读提示：Methods 2.10 Western blotting |
| 机制验证 | BACH1过表达质粒：pcDNA3.1-BACH1，转染浓度2.5 mg/L，转染24h后加药；双荧光素酶报告基因：pGL3-ABCC1和pGL3-mutABCC1；AMPK抑制剂CC浓度10 μmol/L；JQ1浓度500 nmol/L。 阅读提示：Methods 2.8 Cell transfection; 2.15 Dual-luciferase assay; 2.7 Cell culture and treatment |