虚拟筛选与分子对接
发现潜在的FLT3抑制剂
对ZINC in vivo库中60,411个小分子进行分子对接，筛选出前1%的化合物，并通过标准精度和XP精度对接评估foretinib与FLT3的结合。
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Foretinib通过抑制FLT3并克服导致Quizartinib和Gilteritinib耐药的继发突变在急性髓系白血病中有效
Foretinib Is Effective in Acute Myeloid Leukemia by Inhibiting FLT3 and Overcoming Secondary Mutations That Drive Resistance to Quizartinib and Gilteritinib
实验完整度
高结合虚拟筛选、体外细胞实验、体内CDX和PDX模型验证，涵盖功能验证和机制验证。
主要模型
FLT3-ITD突变的人AML细胞系（MV4-11、MOLM13） 表达FLT3-ITD或FLT3-ITD-TKD突变的Ba/F3细胞 NSG小鼠异种移植模型（MOLM13、MV4-11） PDX模型（患者来源的FLT3-ITD AML细胞）
重点核对
foretinib直接结合FLT3（通过CETSA验证） foretinib对FLT3-ITD细胞系和原代细胞的IC50值 foretinib在CDX和PDX模型中的体内疗效 foretinib对继发耐药突变（如F691L）的抑制作用
摘要
FLT3内部串联重复（FLT3-ITD）突变是与急性髓系白血病（AML）患者不良预后相关的最常见体细胞改变之一。临床批准的FLT3激酶抑制剂gilteritinib和quizartinib可改善FLT3-ITD突变AML患者的生存，但其长期疗效受限于获得性继发耐药突变。在本研究中，我们对60,411个小分子库进行了虚拟筛选，并确定foretinib为一种有效的FLT3抑制剂。对BeatAML数据库的综合分析显示，在FLT3-ITD AML患者中，foretinib的IC50值低于其他现有FLT3抑制剂。Foretinib直接结合FLT3并有效抑制FLT3信号传导。Foretinib强效抑制人AML细胞系和原代FLT3-ITD突变AML细胞的增殖并促进凋亡。Foretinib还显著延长了携带细胞来源和患者来源FLT3-ITD异种移植物的小鼠的生存，显示出比临床批准的FLT3抑制剂更强的治疗FLT3-ITD AML的效力。此外，foretinib对赋予quizartinib和gilteritinib耐药的FLT3-ITD继发突变显示出强效活性。这些发现支持foretinib治疗FLT3-ITD突变AML患者的潜力，特别是那些在其他FLT3抑制剂治疗失败后携带继发突变的患者。意义：Foretinib在FLT3-ITD突变AML中表现出优于已批准药物的疗效，并在介导对临床FLT3抑制剂耐药的继发FLT3突变AML中保留活性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Foretinib是否能有效抑制FLT3-ITD突变驱动的AML，并克服一线FLT3抑制剂（quizartinib、gilteritinib）的继发耐药突变？
- 核心机制
- Foretinib通过直接结合FLT3，抑制其激酶活性及下游STAT5、ERK、AKT信号通路，从而抑制白血病细胞增殖并诱导凋亡。
- 主要证据
- 体外实验显示foretinib抑制FLT3-ITD细胞系（IC50纳摩尔级）和患者原代细胞，并抑制FLT3下游信号；体内CDX和PDX模型显示foretinib显著延长小鼠生存，且优于quizartinib和gilteritinib。
- 研究意义
- 本研究表明foretinib可能为FLT3-ITD AML患者，尤其对现有FLT3抑制剂产生继发耐药的患者提供新的治疗选择。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外药效评估
评估foretinib对FLT3-ITD细胞的抗增殖和促凋亡作用
使用CellTiter-Glo检测foretinib对多种AML细胞系（MV4-11、MOLM13等）和Ba/F3突变细胞系的细胞活力影响；通过流式细胞术分析细胞周期和凋亡；Western blot检测FLT3及下游信号蛋白磷酸化水平。
体内疗效评估
评估foretinib在异种移植模型中的抗白血病效果
将MOLM13、MV4-11细胞或Ba/F3 FLT3-ITD-TKD细胞注射入NSG或BALB/c小鼠，口服foretinib、quizartinib、gilteritinib或对照，监测白血病负荷和生存期。
PDX模型验证
验证foretinib对患者来源AML细胞的疗效
将含FLT3-ITD突变或FLT3-ITD/DNMT3A/NPM1突变的患者原代细胞移植入NOG小鼠，建立PDX模型，口服药物治疗后评估白血病负荷及生存期。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
细胞活力检测
细胞凋亡和周期分析
蛋白表达分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞活力检测 | CellTiter-Glo发光细胞活力检测试剂盒 | Promega | -- |
| 流式细胞术 | BD LSRFortessa流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| 细胞培养 | RPMI1640培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | BBI Life Sciences | -- | |
| 重组人IL3 | R&D Systems | -- | |
| 重组人SCF | R&D Systems | -- | |
| 重组人IL6 | R&D Systems | -- | |
| Western blotting | 抗pFLT3抗体 | Cell Signaling Technology | 3464 |
| 抗FLT3抗体 | Cell Signaling Technology | 3462 | |
| 抗pSTAT5抗体 | Cell Signaling Technology | 9351 | |
| 抗STAT5抗体 | Cell Signaling Technology | 9363 | |
| 抗ERK抗体 | Cell Signaling Technology | 4695 | |
| 抗pERK抗体 | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| 抗AKT抗体 | Cell Signaling Technology | 9272 | |
| 抗pAKT抗体 | Cell Signaling Technology | 4060 | |
| HRP偶联的tubulin抗体 | Proteintech | HRP-66031 | |
| PARP1抗体 | Proteintech | 13371-1-AP | |
| Caspase8抗体 | Proteintech | 13423-1-AP | |
| 药物处理 | Foretinib | Targetmol | -- |
| Quizartinib | Targetmol | -- | |
| Gilteritinib | Abmole | -- | |
| 细胞分离 | Lymphoprep试剂 | Stemcell Technologies | -- |
| 集落形成实验 | MethoCult甲基纤维素培养基H4435 | Stemcell Technologies | -- |
| 细胞活力检测 | VICTOR Nivo酶标仪 | Revvity | -- |
| 蛋白质印迹 | ChemiDoc MP成像系统 | Bio-Rad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞活力检测 | 细胞密度为5000细胞/孔，处理时间为48小时，药物浓度梯度需覆盖0-300 nmol/L（foretinib） 阅读提示：Materials and Methods: Cell viability assay |
| 体内实验 | 细胞注射量：MOLM13/MV4-11为5×10^6，Ba/F3为2×10^6；给药剂量：foretinib 15 mg/kg、quizartinib 10 mg/kg、gilteritinib 30 mg/kg；给药方式：口服；给药周期：连续2周或直至对照小鼠死亡 阅读提示：Materials and Methods: In vivo efficacy studies; Figure 3 legend |
| PDX模型 | NOG小鼠预处理：busulfan 20 mg/kg；移植细胞数：PDX #1为2×10^6，PDX #2为5×10^5（二次移植）；给药方案：foretinib 15 mg/kg/day，quizartinib 10 mg/kg/day，gilteritinib 30 mg/kg/day，持续3周 阅读提示：Materials and Methods: In vivo efficacy studies; Figure 6 legend |
| 蛋白质印迹 | 处理时间：2小时；检测pFLT3、pSTAT5、pERK、pAKT 阅读提示：Materials and Methods: Western blotting analysis; Figure 2 legend |