建立患者来源肿瘤模型
获得可用于药物筛选的患者肿瘤细胞，并验证其与原始肿瘤的一致性。
从患者手术或活检组织分离肿瘤细胞，通过体外培养或体内PDX扩增获得足够的细胞量，并进行STR分型、SNP芯片等验证。
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高通量药物筛选原代肿瘤细胞为高危儿童癌症治疗策略的制定提供依据
High-Throughput Drug Screening of Primary Tumor Cells Identifies Therapeutic Strategies for Treating Children with High-Risk Cancer
实验完整度
高研究包含体外药物筛选、PDX体内验证、临床样本相关性分析、细胞系机制验证等多个独立证据层级。
主要模型
125例患者来源肿瘤样本（体外培养或新鲜分离） 患者来源异种移植模型（PDX） SHEP-21N神经母细胞瘤细胞系
重点核对
在体外HTS中使用的药物库包含的药物数量（126种，或56、70、111、112种） 药物浓度范围（0.5 nmol/L–5 μmol/L） 肿瘤细胞扩增方式（新鲜分离、体外扩增、体内扩增） 样本验证方法（STR分型、SNP芯片等） 体内PDX模型的给药方案和途径（文中未明确说明）
摘要
对于参加精准医学计划的儿童癌症患者中，约有三分之一的患者，其分子谱分析未能得出治疗建议。为了确定治疗这些高危儿科患者的潜在策略，我们对125份患者来源的样本进行了体外筛选，药物库包含126种抗癌药物。肿瘤细胞扩增不影响药物反应，且82%的对扩增肿瘤细胞的筛选在患者仍在接受临床治疗时完成。高通量药物筛选（HTS）证实了NTRK、BRAF和ALK中的活化基因组改变与相匹配的靶向药物反应之间的已知关联。体外结果在患者来源的异种移植模型体内得到进一步验证，并与接受治疗患者的临床反应一致。此外，通过药物之间的敏感性谱相关性可以预测有效的联合用药。进一步地，分子整合HTS确定了WEE1和MEK抑制敏感性的生物标志物。将HTS纳入精准医学计划是加速改进识别治疗高危儿科癌症的有效生物标志物驱动治疗策略的有力工具。意义：将HTS与分子谱分析相结合是扩大精准医学的有力工具，可支持药物治疗建议并拓宽高危儿科癌症可用的治疗选择。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 对于分子谱分析无法提供治疗建议的高危儿童癌症患者，能否通过体外高通量药物筛选识别潜在治疗策略？
- 核心机制
- MYCN激活可能是WEE1抑制剂疗效的预测性生物标志物；PIK3R1突变和/或AKT3拷贝数增加可能与部分脑肿瘤对MEK抑制剂敏感性相关（后者需进一步功能验证）。
- 主要证据
- 体外HTS显示NTRK、BRAF、ALK等驱动变异与相应靶向药物敏感性相关，并经PDX模型和临床反应验证；通过基因表达相关性分析发现WEE1抑制剂敏感性相关基因集，并在SHEP-21N细胞中验证MYCN依赖性。
- 研究意义
- 研究表明将HTS纳入精准医学计划可扩大高危儿童癌症的治疗选择，并为发现新的生物标志物和联合治疗策略提供依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外高通量药物筛选（HTS）
评估肿瘤样本对126种抗癌药物的敏感性，建立药物反应谱。
将肿瘤细胞接种于384或1536孔板，暴露于药物库，检测细胞活力，计算AUC和IC50。
体内PDX验证
验证体外药物反应在体内的重现性。
将PDX肿瘤植入NSG小鼠，待肿瘤体积约100 mm3后随机分组，给予药物或对照，监测肿瘤体积和EFS。
药物敏感性相关性与联合用药预测
通过药物反应谱相关性预测潜在有效联合方案。
计算药物AUC Z分数之间的Pearson相关系数，识别具有相似反应谱的药物对，并选择代表性组合进行体内验证。
分子整合与生物标志物发现
识别与药物敏感性相关的分子特征和预测性生物标志物。
对HTS结果与WGS/RNA-seq数据整合，进行基因表达相关性分析、GSEA，并用细胞系实验验证MYCN与WEE1抑制剂敏感性的关联。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 组织解离 | 人组织解离试剂盒 | Miltenyi Biotec | -- |
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | -- | -- |
| Neurobasal-A培养基 | -- | -- | |
| IMDM培养基 | -- | -- | |
| MEM α培养基 | -- | -- | |
| RPMI 1640培养基 | -- | -- | |
| StemSpan无血清扩增培养基II | Stem Cell Technologies | -- | |
| AIM V无血清培养基 | -- | -- | |
| 单核细胞培养基 | PromoCell | -- | |
| 胎牛血清 | Life Technologies | -- | |
| 胰岛素-转铁蛋白-硒 | Life Technologies | -- | |
| 庆大霉素 | Life Technologies | -- | |
| Y-27632 | Selleck Chemicals | -- | |
| GlutaMAX-I | -- | -- | |
| 非必需氨基酸 | -- | -- | |
| HEPES | -- | -- | |
| 抗生素/抗真菌溶液 | -- | -- | |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | -- | -- | |
| 表皮生长因子 | -- | -- | |
| 肝素 | -- | -- | |
| 血小板衍生生长因子-AA | -- | -- | |
| PDGF-BB | -- | -- | |
| StemSpan CD34+扩增补充剂 | -- | -- | |
| 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| Accutase | Sigma-Aldrich | -- | |
| RPMI 1640培养基 | Gibco | 22400–089 | |
| 抗生素-抗真菌溶液 | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| 多西环素 | Sigma-Aldrich | D3447 | |
| 药物处理 | 溴化噻哌铵 | -- | -- |
| 二甲基亚砜 | -- | -- | |
| Adavosertib | -- | -- | |
| 曲美替尼 | -- | -- | |
| 他拉唑帕尼 | -- | -- | |
| alisertib | -- | -- | |
| SN-38 | -- | -- | |
| veliparib | -- | -- | |
| 奥拉帕利 | -- | -- | |
| 司美替尼 | -- | -- | |
| 考比替尼 | -- | -- | |
| 硫酸拉罗替尼 | -- | -- | |
| 达拉非尼 | -- | -- | |
| 维莫非尼 | -- | -- | |
| 色瑞替尼 | -- | -- | |
| 克唑替尼 | -- | -- | |
| 阿来替尼 | -- | -- | |
| 替西罗莫司 | -- | -- | |
| 瑞博西尼 | -- | -- | |
| 帕博西尼 | -- | -- | |
| 阿贝西利 | -- | -- | |
| 伊立替康 | -- | -- | |
| 替莫唑胺 | -- | -- | |
| 劳拉替尼 | -- | -- | |
| 硼替佐米 | -- | -- | |
| 卡非佐米 | -- | -- | |
| 伊沙佐米 | -- | -- | |
| dinaciclib | -- | -- | |
| 帕比司他 | -- | -- | |
| gedatolisib | -- | -- | |
| TAK228 | -- | -- | |
| vistusertib | -- | -- | |
| 维奈托克 | -- | -- | |
| 体外HTS | Multidrop Combi试剂分液器 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Hamilton STAR液体处理机器人 | Hamilton | -- | |
| Echo 550声波液体处理器 | Labcyte | -- | |
| CellTiter-Glo发光细胞活力检测试剂盒 | Promega | -- | |
| CyQUANT直接细胞增殖检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Operetta高内涵成像系统 | PerkinElmer | -- | |
| ActivityBase软件 | IDBS | -- | |
| 细胞培养 | 384孔微孔板 | Greiner Bio-One | 781080 |
| 药物处理 | Tecan D300e数字分液器 | Tecan | -- |
| 细胞活力检测 | CellTiter-Glo 2.0发光细胞活力检测试剂盒 | Promega | -- |
| EnSpire Alpha多功能酶标仪 | PerkinElmer | -- | |
| 数据分析 | GraphPad Prism | -- | version |
| R | -- | version | |
| 流式细胞术 | 碘化丙啶 | Sigma-Aldrich | P4864 |
| 无DNA酶的RNase | Roche | 11119915001 | |
| BD FACSCanto A流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| FlowJo | BD Biosciences | 10.8.1 | |
| Western blot | HRP标记的绵羊抗小鼠IgG | GE Healthcare | NA931V |
| HRP标记的山羊抗兔IgG | Cell Signaling Technology | 7074 | |
| HRP标记的马抗小鼠IgG | Cell Signaling Technology | 7076 | |
| 小鼠MYCN单克隆抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53993 | |
| 小鼠β-actin抗体 | Sigma | A2228 | |
| 兔phospho-p44/42 MAPK抗体 | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| 兔p44/42 MAPK抗体 | Cell Signaling Technology | 4695 | |
| 兔phospho-Akt抗体 | Cell Signaling Technology | 4058 | |
| 兔Akt抗体 | Cell Signaling Technology | 9272 | |
| 兔phospho-S6核糖体蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 2211 | |
| 小鼠S6核糖体蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 2317 | |
| 兔β-actin抗体 | Cell Signaling Technology | 8457 | |
| 细胞培养 | MycoAlert支原体检测试剂盒 | Lonza | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体外HTS | 药物库药物数量（126或部分库）、药物浓度范围（0.5 nmol/L–5 μmol/L）、检测时间点（药物添加后3天）、阳性/阴性对照（thonzonium bromide和DMSO） 阅读提示：Materials and Methods: In vitro HTS |
| 细胞培养 | 肿瘤类型特异性培养基及补充因子、氧条件（参见补充图S1A）、细胞扩增时间（中位数112天体外、92天体内）、细胞密度 阅读提示：Materials and Methods: Tissue dissociation and establishment of patient-derived cultures |
| 体内PDX验证 | PDX肿瘤接种方式（皮下或颅内）、肿瘤体积约100 mm3开始治疗、给药方案和途径（文中未明确说明，见补充方法）、治疗周期（最多4周） 阅读提示：Materials and Methods: In vivo efficacy studies; Supplementary Materials and Methods |
| 基因表达相关性分析 | RNA-seq数据匹配数量（98样本有WGS+RNA-seq）、基因表达阈值（TPM>1在≥5样本）、Pearson相关系数等 阅读提示：Materials and Methods: Gene expression correlation analysis with drug efficacy |
| SHEP-21N实验 | 多西环素浓度（1 μg/mL）和预处理时间（≥72小时）、细胞密度（750或1000细胞/孔）、adavosertib浓度范围（14.6 nmol/L–15 μmol/L）、检测时间点（第1天和第3天） 阅读提示：Materials and Methods: In vitro culture of SHEP-21N; MYCN-dependent effects of adavosertib |