转座子突变筛选
鉴定与BRAFV600E协同促进肺肿瘤恶性进展的候选基因。
构建BrafCA/RCL::SB/T2-Onc2小鼠，经鼻内吸入Ad5-CMV-CRE启动肺肿瘤，监测生存期，收集28个肿瘤进行SB插入位点测序和分析。
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转座子突变揭示RBMS3沉默促进BRAFV600E驱动的肺肿瘤恶性进展
Transposon Mutagenesis Reveals RBMS3 Silencing as a Promoter of Malignant Progression of BRAFV600E-Driven Lung Tumorigenesis
实验完整度
高包含转座子突变筛选、CRISPR/Cas9基因编辑、类器官培养、GEM模型、免疫组化、qRT-PCR及TCGA数据分析等多个独立证据层级，并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
BrafCA/RCL::SB/T2-Onc2 (BRT)小鼠 BrafCAT; H11LSL-CAS9 (BC)小鼠肺类器官 EGFRL858R GEM模型 (SREC小鼠)
重点核对
RBMS3的CRISPR/Cas9编辑效率及Rbms3 mRNA表达水平 RBMS3沉默与BRAFV600E或EGFRL858R协同的肿瘤负荷和肿瘤直径变化 WNT/β-catenin通路靶基因（Ctnnb1、Ccnd1、Axin2、Lgr5、c-Myc）的表达 D+T和LGK974处理对肿瘤负荷的影响 TCGA中RBMS3拷贝数缺失与预后的相关性
摘要
突变激活的BRAF在大约7%的人类肺腺癌中被检测到，BRAFT1799A作为FDA批准的BRAFV600E癌蛋白信号通路抑制剂治疗患者的预测性生物标志物。在基因工程小鼠（GEM）模型中，BRAFV600E在肺上皮中的表达启动了良性肺肿瘤的生长，这些肿瘤在没有额外基因改变的情况下，很少进展为恶性肺腺癌。为了识别与BRAFV600E协同促进恶性进展的基因，我们使用了Sleeping Beauty介导的转座子突变，这极大地加速了致死性肺癌的出现。在识别出的基因中包括Rbms3，它编码一种RNA结合蛋白，先前被认为是一种推定的肿瘤抑制因子。通过CRISPR/Cas9基因编辑沉默RBMS3促进了BRAFV600E肺类器官的生长，并在BRAFV600E和EGFRL858R GEM模型中促进了具有独特微乳头状结构的恶性肺癌的发展。BRAFV600E/RBMS3Null肺肿瘤表现出Ctnnb1、Ccnd1、Axin2、Lgr5和c-Myc mRNA的表达升高，表明RBMS3沉默通过WNT/β-catenin信号轴升高了信号传导。尽管RBMS3沉默使BRAFV600E驱动的肺肿瘤对达拉非尼联合曲美替尼的作用产生耐药性，但这些肿瘤对porcupine（一种WNT配体分泌所必需的酰基转移酶）的抑制敏感。对癌症基因组图谱（TCGA）患者样本的分析显示，包含RBMS3的染色体3p24在非小细胞肺癌中频繁缺失，并与不良预后相关。总之，这些数据揭示了RBMS3作为肺癌抑制因子的作用，并提示RBMS3沉默可能促进恶性NSCLC进展。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 哪些基因与BRAFV600E协同促进肺肿瘤的恶性进展，以及RBMS3沉默在其中的作用和机制？
- 核心机制
- RBMS3沉默通过上调WNT/β-catenin信号通路（增加Ctnnb1、Ccnd1、Axin2、Lgr5和c-Myc表达）促进BRAFV600E驱动的肺肿瘤恶性进展。
- 主要证据
- SB-TIM筛选鉴定了Rbms3作为候选基因；CRISPR/Cas9编辑Rbms3显著增加BRAFV600E或EGFRL858R小鼠模型的肿瘤负荷和肿瘤直径；类器官实验显示RBM3沉默促进生长；qRT-PCR显示WNT靶基因表达升高；TCGA数据显示RBMS3缺失与不良预后相关。
- 研究意义
- RBMS3沉默可能促进恶性NSCLC进展，并为BRAF突变肺癌的靶向治疗提供新策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体内CRISPR/Cas9编辑验证
验证RBMS3沉默是否与BRAFV600E协同促进肺肿瘤进展。
通过气管内滴注表达CRE和sgRNA的慢病毒感染BrafCAT或BrafCAT; H11LSL-CAS9小鼠，在11周后分析肿瘤负荷和肿瘤直径。
肺类器官培养
在体外验证RBMS3沉默与BRAFV600E协同促进肺肿瘤细胞生长。
从感染sgNT-CRE或sgRbms3-CRE的BC小鼠肺中制备单细胞悬液，在Matrigel中培养类器官，比较大小及Rbms3表达。
EGFRL858R模型验证
验证RBMS3沉默是否与其他驱动基因（EGFRL858R）也协同促进肺肿瘤进展。
使用EGFRL858R GEM模型（SREC小鼠），感染sgRbms3-CRE或sgNT-CRE慢病毒，诱导EGFRL858R表达后分析肿瘤进展。
WNT通路机制研究
探究RBMS3沉默促进肿瘤进展的分子机制，是否通过WNT/β-catenin通路。
通过免疫荧光检测β-catenin蛋白表达，通过qRT-PCR检测BC类器官中WNT靶基因（Ctnnb1, Ccnd1, Axin2, Lgr5, c-Myc）mRNA水平。
药物治疗实验
评估RBMS3沉默对BRAFV600E靶向治疗（D+T）和WNT通路抑制（LGK974）敏感性的影响。
BC小鼠感染sgNT-CRE或sgRbms3-CRE，6周后随机分组，分别用vehicle、D+T或LGK974治疗5周，分析肿瘤负荷及pERK表达。
TCGA数据库分析
评估RBMS3在人类肺癌中的拷贝数变异及预后意义。
使用cBioPortal分析TCGA-LuSC和TCGA-LuAD中RBMS3拷贝数变化，并分析3p缺失与预后的关系。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| DNA提取 | Gentra Puregene细胞DNA提取试剂盒 | Qiagen | 158767 |
| 测序 | Illumina 454测序平台 | Illumina | -- |
| 质粒构建 | Q5高保真DNA聚合酶 | NEB | -- |
| 细胞转染 | Transit-X2转染试剂 | Mirus | MIR 6004 |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 类器官培养 | 基质胶 | Corning | #356327 |
| Advanced DMEM/F12培养基 | Gibco | -- | |
| B-27补充剂 | Thermo Fisher Scientific | #17504001 | |
| N-2补充剂 | Thermo Fisher Scientific | #17502001 | |
| N-乙酰半胱氨酸 | Sigma-Aldrich | #A0737 | |
| 胃泌素 | Sigma-Aldrich | G9020 | |
| 烟酰胺 | Sigma-Aldrich | #47865-U | |
| 表皮生长因子 | Peprotech | #AF-100-15 | |
| 成纤维细胞生长因子10 | Peprotech | #100-26 | |
| R-Spondin-1 | Peprotech | #315-32 | |
| 头蛋白 | Peprotech | #25038 | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | #15596026 |
| RNeasy FFPE试剂盒 | Qiagen | #73504 | |
| DNeasy血液和组织DNA提取试剂盒 | Qiagen | #69504 | |
| QIAamp DNA提取试剂盒 | Qiagen | #56404 | |
| 逆转录 | iSCRIPT逆转录预混液 | Bio-Rad | #1708841 |
| qRT-PCR | SSOAdvanced通用探针预混液 | Bio-Rad | #1725280 |
| TaqMan基因表达检测 | Applied Biosystems | -- | |
| 免疫组化 | c-MYC抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-764 |
| pro-SPC抗体 | Millipore | AB3786 | |
| NKX2.1/TTF-1抗体 | Abcam | 76013-EP1584Y | |
| EGFR-pY1068抗体 | Cell Signaling Technology | 3777 | |
| pERK T202/Y204抗体 | Cell Signaling Technology | 4370 | |
| β-连环蛋白D10A8 XP抗体 | Cell Signaling Technology | 8480 | |
| ImmPRESS马抗兔IgG聚合物试剂盒 | Vector Laboratories | MP7401 | |
| ImmPACT DAB底物 | Vector Laboratories | SK-4103-400 | |
| 柠檬酸盐缓冲液pH6 | Sigma-Aldrich | #C9999 | |
| BLOXALL封闭液 | Vector Laboratories | SP-6000-100 | |
| 正常马血清封闭液 | Vector Laboratories | S2012-50 | |
| 酸性酒精 | Thermo Fisher Scientific | 6769008 | |
| Scott's自来水蓝化液 | VWR | 100504-452 | |
| Permount封片剂 | Thermo Fisher Scientific | SP15-500 | |
| 免疫荧光 | SB11转座酶抗体 | R&D Systems | #AF2798 |
| 细胞培养 | TrypLE消化液 | Thermo Fisher Scientific | #12604013 |
| 胶原酶 | Life Technologies | 17100-017 | |
| 分散酶 | Corning | 354235 | |
| 弹性蛋白酶 | Worthington | 2279 | |
| 脱氧核糖核酸酶I | Sigma | DN25-100mg | |
| 红细胞裂解液 | eBioscience | 00-4333-57 | |
| DNA提取 | Gentra Puregene细胞DNA提取试剂盒 | Qiagen | 158767 |
| 质粒构建 | Q5定点突变试剂盒 | NEB | #E0554S |
| 病毒包装 | pCMV-VSV-G质粒 | Addgene | 8454 |
| psPAX2质粒 | Addgene | 12260 | |
| pCMV-Δ8.9质粒 | Addgene | -- | |
| pCMV-SB11质粒 | Addgene | 26552 | |
| 测序分析 | Aperio Scanscope扫描仪 | Leica | -- |
| 3D Histech Pannoramic MIDI扫描仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 基因组分析 | BWA比对软件 | -- | -- |
| GATK | -- | -- | |
| SAMtools | -- | -- | |
| Picard工具 | -- | -- | |
| RetroSeq | -- | -- | |
| bedtools | -- | -- | |
| 图像分析 | CellProfiler | -- | -- |
| QuantCenter | 3D Histech | -- | |
| 数据库分析 | cBioPortal | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 转座子突变筛选 | 小鼠品系（BrafCA; RCL::SB; T2/Onc2）及基因型确认；Ad5-CMV-CRE剂量（106 pfu）；观察时间（250天）；肿瘤微切割标准。 阅读提示：Materials and Methods: Vertebrate animals; Results: The BrafCA|SB|lung insertional mutagenesis screen |
| CRISPR/Cas9基因编辑 | sgRNA序列（Pool1和Pool2）；慢病毒滴度（5×10^4 - 1×10^5 pfu）；感染方式（气管内滴注）；终点时间（11周或13周）。 阅读提示：Materials and Methods: Plasmid cloning, lentivirus production, cell transduction; Results: Rbms3 is a tumor suppressor |
| 类器官培养 | 组织消化酶组合及浓度；培养基成分（生长因子等）；培养时间（7天）；细胞接种密度（50,000 cells/well）。 阅读提示：Materials and Methods: Cell lines, 2D and 3D culture conditions, and imaging |
| EGFRL858R模型 | 小鼠基因型（SPC::CRE-ERT2; Rosa26-LSL-rtTa3; TetO-EGFRL858R）；多西环素饮食诱导；慢病毒剂量（1×10^5 pfu）；终点时间（11周）。 阅读提示：Materials and Methods: Vertebrate animals; Results: Rbms3 cooperates with EGFRL858R |
| 药物治疗实验 | 药物剂量（dabrafenib 75 mg/kg, trametinib 1 mg/kg, LGK974 5 mg/kg）；给药方式（每日一次）；治疗周期（5周）；治疗开始时间（6周后）。 阅读提示：Materials and Methods: Vertebrate animals; Results: Vertical inhibition of BRAFV600E signaling |
| TCGA分析 | 数据库版本（TCGA-LuSC, TCGA-LuAD）；拷贝数变异定义（CN=-1为缺失）；RBMS3的3p24区域。 阅读提示：Materials and Methods: cBioPortal analysis of human lung cancer databases |