验证TRIM60在巨噬细胞中的功能
确定TRIM60对TLR介导的炎症因子产生的影响
在RAW264.7细胞中通过shRNA敲低Trim60，并利用LPS或CpG刺激，通过qPCR和ELISA检测炎症因子产生；同时使用TRIM60基因敲除小鼠来源的BMDMs进行验证。
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TRIM60介导的TAB2 SUMO化抑制MAPK/NF-κB激活和先天免疫应答
The SUMOylation of TAB2 mediated by TRIM60 inhibits MAPK/NF-κB activation and the innate immune response
实验完整度
高包含体外细胞实验（RAW264.7、HEK293T、BMDMs、MEFs）、生化实验（IP-MS、体外SUMO化、免疫共沉淀、荧光素酶报告基因）以及体内实验（LPS休克模型、李斯特菌感染模型），并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDMs） RAW264.7巨噬细胞系 小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs） TRIM60基因敲除小鼠（LPS诱导休克模型和李斯特菌感染模型）
重点核对
TRIM60敲低或敲除后，LPS、CpG或TNFα刺激下的MAPK和NF-κB激活水平 TRIM60与TAB2的相互作用及其关键结构域（TRIM60 SPRY、TAB2 N端） 体外SUMO化实验中TRIM60对TAB2 K329、K562位点的SUMO化修饰 TAB2 SUMO化对TRAF6/TAB2/TAK1或RIP1/TAB2/TAK1复合物形成的影响 体内LPS诱导休克模型和李斯特菌感染模型中TRIM60敲除小鼠的表型
摘要
TAK1信号体的激活对于介导针对病原体入侵的先天免疫应答至关重要，并受到多层翻译后修饰的调控，包括泛素化、SUMO化和磷酸化；然而，其潜在的分子机制尚未完全阐明。本研究发现，TRIM60负向调控TAK1信号体的形成和激活。巨噬细胞中TRIM60缺陷导致MAPK和NF-κB激活增强，并伴随促炎细胞因子水平升高，但I型干扰素（IFN-I）水平不受影响。免疫沉淀-质谱分析鉴定出TAB2是TRIM60进行SUMO化而非泛素化的靶点，导致TRAF6/TAB2/TAK1复合物形成受损以及下游MAPK和NF-κB通路激活受阻。TRIM60介导的TAB2 SUMO化位点被鉴定为K329和K562；将这些赖氨酸替换为精氨酸可消除TAB2的SUMO化。体内实验表明，TRIM60缺陷小鼠对LPS诱导的感染性休克和单核细胞增生李斯特菌感染表现出增强的免疫应答。我们的数据揭示，TRIM60介导的TAB2 SUMO化是调控先天免疫应答的一种新机制，可能为控制抗菌免疫应答提供新策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TRIM60如何调控TLR介导的先天免疫应答？其分子机制是什么？
- 核心机制
- TRIM60作为E3 SUMO连接酶，通过其RING和SPRY结构域与TAB2相互作用，并在K329和K562位点介导TAB2的SUMO化，进而抑制TRAF6/TAB2/TAK1（或RIP1/TAB2/TAK1）信号体的形成，从而负向调控MAPK和NF-κB信号通路。
- 主要证据
- TRIM60缺陷巨噬细胞中MAPK/NF-κB激活增强且炎症因子产生增多；IP-MS和免疫共沉淀证明TRIM60与TAB2相互作用；体外SUMO化实验证明TRIM60介导TAB2 K329和K562位点SUMO化；TAB2 SUMO化突变体（K329R/K562R）的回复实验显示其抗性并增强信号体形成；体内实验显示TRIM60敲除小鼠对LPS休克更敏感但更抗李斯特菌感染。
- 研究意义
- 揭示了TRIM60介导的TAB2 SUMO化是调控先天免疫应答的一种新机制，可能为控制抗菌免疫应答提供新策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估TRIM60对MAPK和NF-κB信号通路的影响
检测TRIM60缺失对TLR或TNFR介导的信号通路激活的影响
通过Western blot检测WT和TRIM60缺陷的BMDMs、RAW细胞和MEFs中ERK、JNK、p38和IκBα的磷酸化水平；使用荧光素酶报告基因检测NF-κB活性。
鉴定TRIM60相互作用蛋白
寻找TRIM60调控TLR信号通路的分子靶点
通过免疫沉淀-质谱（IP-MS）鉴定TRIM60相互作用蛋白；在HEK293T细胞和RAW细胞中通过免疫共沉淀验证TRIM60与TAB2的相互作用；使用截短突变体确定相互作用的关键结构域。
验证TRIM60介导TAB2的SUMO化
确定TRIM60是否作为E3 SUMO连接酶对TAB2进行修饰
通过外源表达和体内SUMO化实验检测TAB2的SUMO化水平；通过体外SUMO化实验确认TRIM60直接介导TAB2的SUMO化，并鉴定SUMO化位点（K329和K562）。
研究TAB2 SUMO化对信号复合物形成和信号通路的影响
阐明TAB2 SUMO化如何影响下游信号传导
通过免疫共沉淀检测TRAF6/TAB2/TAK1或RIP1/TAB2/TAK1复合物的形成；使用TAB2 SUMO化突变体（K329R/K562R）进行功能回复实验，检测复合物形成和MAPK/NF-κB激活。
体内功能验证
评估TRIM60在体内对免疫应答的影响
利用TRIM60基因敲除小鼠，建立LPS诱导的感染性休克模型和单核细胞增生李斯特菌感染模型，监测生存率、细菌载量和血清细胞因子水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 刺激 | 脂多糖（大肠杆菌O127:B8） | Sigma-Aldrich | L3129 |
| CpG寡脱氧核苷酸1826 | InvivoGen | tlrl-1826 | |
| 小鼠肿瘤坏死因子α | PeproTech | AF-315-01A | |
| 药物处理 | MG132蛋白酶体抑制剂 | Sigma-Aldrich | 474790 |
| 氯喹 | Sigma-Aldrich | C6628 | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 蛋白质检测 | 抗磷酸化ERK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 4370 |
| 抗磷酸化p38抗体 | Cell Signaling Technology | 9215 | |
| 抗磷酸化JNK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | 9251 | |
| 抗磷酸化IκBα抗体 | Cell Signaling Technology | 9246 | |
| 抗TAK1抗体 | Cell Signaling Technology | 4505 | |
| 抗TAB2抗体 | Cell Signaling Technology | 3745 | |
| 抗SUMO1抗体 | Cell Signaling Technology | 4930 | |
| 抗HA标签抗体 | Cell Signaling Technology | 3724 | |
| 抗ERK1/2抗体 | Zen Bioscience | 201245-4A4 | |
| 抗p38抗体 | Zen Bioscience | 200782 | |
| 抗JNK1/2抗体 | Zen Bioscience | 201001 | |
| 抗IκBα抗体 | Zen Bioscience | 200517 | |
| 抗TRAF6抗体 | Zen Bioscience | 380803 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | A2228 | |
| 抗Flag标签抗体 | Sigma-Aldrich | F1804 | |
| HRP偶联抗Flag标签抗体 | Sigma-Aldrich | A8592 | |
| 抗Myc标签抗体 | Invitrogen | MA1-21316 | |
| HRP偶联抗Myc标签抗体 | Invitrogen | MA1-81357 | |
| HRP偶联山羊抗兔IgG抗体 | Invitrogen | 31460 | |
| 抗TRAF6抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-8409 | |
| 抗TAB2抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-398188 | |
| 抗GST标签抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-53909 | |
| 抗RIP1抗体 | BD Bioscience | 610458 | |
| 抗泛素抗体 | Merck Millipore | 04-263 | |
| 抗K63连接泛素抗体 | Enzo Life Science | BML-PW0600 | |
| HRP偶联抗小鼠二抗 | Rockland | KCB002 | |
| 免疫沉淀 | 抗HA磁珠 | Pierce | 88836 |
| 蛋白A/G琼脂糖珠 | Beyotime Biotechnology | P2028 | |
| RNA提取和qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| iScript cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad | -- | |
| 2×iTaq通用SYBR Green Supermix | Bio-Rad | -- | |
| CFX Connect实时荧光定量PCR仪 | Bio-Rad | -- | |
| ELISA | 小鼠IL-6 ELISA试剂盒 | eBioscience | -- |
| 小鼠TNFα ELISA试剂盒 | eBioscience | -- | |
| 小鼠IL-1β ELISA试剂盒 | eBioscience | -- | |
| 蛋白质纯化 | GS4B琼脂糖珠 | QIAGEN | -- |
| Superdex 200凝胶过滤色谱柱 | GE Healthcare | -- | |
| Superose 6凝胶过滤色谱柱 | GE Healthcare | -- | |
| AKTA蛋白纯化系统 | GE Healthcare | -- | |
| 体外SUMO化 | SUMOlink SUMO-1试剂盒 | Active Motif | 40120 |
| 细胞转染 | pLKO.1慢病毒载体 | -- | -- |
| psPAX2包装质粒 | -- | -- | |
| pMD2.G包膜质粒 | -- | -- | |
| 聚凝胺 | Sigma-Aldrich | H9268 | |
| 嘌呤霉素 | Merck Millipore | 540411 | |
| FACS Aria III流式细胞分选仪 | BD Bioscience | -- | |
| CRISPR/Cas9基因编辑 | pX458质粒 | -- | -- |
| 4D-Nucleofector™ X转染仪 | Lonza | -- | |
| rTaq聚合酶 | TaKaRa | RR901 | |
| pMD19 T载体 | TaKaRa | 3271 | |
| 免疫沉淀 | RIPA裂解缓冲液 | -- | -- |
| 完全蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | -- | |
| NP-40裂解缓冲液 | -- | -- | |
| 蛋白质检测 | NuPAGE 10% Bis-Tris凝胶 | Invitrogen | -- |
| 1X NUPAGE SDS上样缓冲液 | Invitrogen | -- | |
| 质谱分析 | nano-LC 1000纳升液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Q Exactive plus质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 测序 | QuickChange定点突变试剂盒 | Agilent | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与刺激 | BMDMs的分化时间和条件、RAW264.7和HEK293T细胞的培养条件、LPS和CpG的浓度（LPS 20 ng/mL，CpG 2 μM）、TNFα的浓度（20 ng/mL） 阅读提示：Methods: Cell culture and stimulation |
| TRIM60敲低/敲除 | shRNA序列、慢病毒感染方法、TRIM60敲除小鼠的构建方法（Trim60f/f与Ella-Cre杂交） 阅读提示：Methods: Lentivirus package and infection; Plasmids |
| 免疫沉淀和Western blot | 裂解缓冲液（RIPA或NP-40）、蛋白酶抑制剂、抗体（anti-TAB2、anti-HA）、磁珠或蛋白A/G琼脂糖珠 阅读提示：Methods: Immunoprecipitation and western blot analysis |
| 体外SUMO化 | 纯化的GST-TAB2和GST-TRIM60蛋白、E1和E2酶、SUMO1蛋白、反应时间和温度（30°C 3小时） 阅读提示：Methods: Protein purification and in vitro SUMOylation assay |
| 体内实验 | 小鼠品系和年龄、LPS注射剂量（50 mg/kg）、李斯特菌感染剂量（2×10^4 CFU）、观察时间点 阅读提示：Methods: LPS-induced septic shock; L. monocytogenes culture and in vivo infection |