上海富衡 | 4T1 细胞培养常见问题及解决方法

4T1 细胞是源自小鼠乳腺的肿瘤细胞系，在乳腺癌研究中应用广泛。然而，培养 4T1 细胞时，常遇到一些问题，以下将对常见问题及解决方法进行分析。

细胞生长缓慢

1. 培养基及血清问题：4T1 细胞对培养基营养成分要求较为严格。若培养基中关键营养物质缺乏，如氨基酸、维生素等，会导致细胞生长缓慢。另外，血清质量不稳定或批次间差异大，也会影响细胞生长。解决方法是确保使用合适的培养基，如常用的 RPMI - 1640 培养基，并严格按照要求添加 10% - 20% 的优质胎牛血清。同时，购买血清时选择信誉良好的供应商，尽量使用同一批次血清，减少批次间差异对细胞的影响。

   2.培养环境问题：细胞培养箱内温度、二氧化碳浓度及湿度的不稳定，会干扰细胞正常代谢和生长。温度偏离 37℃、二氧化碳浓度不在 5% 左右，都可能导致细胞生长缓慢。需定期校准培养箱的温度和二氧化碳浓度监测装置，确保培养环境稳定。同时，注意培养箱内湿度保持在 95% 左右，防止培养基过快蒸发。

   3.细胞密度问题：接种细胞密度过低，细胞之间的相互作用减少，会影响细胞生长信号传导，导致生长缓慢。但密度过高，营养物质消耗过快，代谢废物积累，同样不利于细胞生长。应根据细胞特性和经验，确定合适的接种密度，一般 4T1 细胞每平方厘米接种5×103−1×104个细胞较为适宜。传代时，严格按照合适比例进行传代。

   

2.  

   细胞形态异常

   1. 消化过度：在细胞传代过程中，胰蛋白酶 - EDTA 消化时间过长，会对细胞造成损伤，导致细胞形态改变，如细胞变圆、皱缩等。应在显微镜下密切观察消化过程，当大部分细胞变圆且开始脱离瓶壁时，立即加入含血清的培养基终止消化。消化时间一般控制在 1 - 3 分钟，具体时间需根据细胞状态和胰蛋白酶浓度进行调整。
   2. 污染影响：细菌、真菌或支原体污染会使细胞形态发生变化。细菌污染时，培养基可能变浑浊，细胞表面可能出现颗粒状物质，细胞形态变得不规则；真菌感染可见培养基中有丝状或绒毛状物体；支原体污染则可能导致细胞生长缓慢、形态改变，如细胞表面出现拉丝现象。预防污染至关重要，操作过程严格遵守无菌原则，定期对培养环境进行消毒，包括培养箱、超净工作台等。若发现污染，轻微污染时可尝试使用抗生素处理，但效果通常不佳；严重污染时，应及时丢弃受污染细胞，防止污染扩散。

      细胞贴壁不牢

      1. 培养瓶表面性质：普通培养瓶可能不适合 4T1 细胞贴壁，需使用经过特殊处理，表面适合细胞贴壁的培养瓶。一些细胞培养瓶表面经过亲水化处理，能增加细胞与瓶壁的黏附力。另外，在接种细胞前，可对培养瓶进行包被处理，如用多聚赖氨酸、明胶等包被，促进细胞贴壁。
      2. 细胞状态及处理：细胞复苏时，若解冻速度过慢或冻存过程中细胞受损，会影响细胞贴壁能力。复苏细胞应快速解冻，一般在 1 - 2 分钟内完成。此外，传代过程中吹打细胞过于剧烈，也会破坏细胞表面的黏附结构，导致贴壁不牢。吹打细胞时应轻柔，避免产生大量气泡，确保细胞均匀分散即可。

      细胞增殖不均

      1. 接种不均匀：接种细胞时，若未能使细胞在培养瓶或培养板中均匀分布，会导致局部细胞密度差异大，从而出现增殖不均的现象。接种时，将细胞悬液加入培养容器后，应轻轻晃动或水平旋转培养容器，使细胞均匀分布。也可使用移液器在培养容器内不同位置多点接种，然后再轻轻混匀。
      2. 营养分布不均：培养板或培养瓶内培养基分布不均匀，局部营养物质浓度不同，会影响细胞增殖。在加入培养基时，应缓慢加入，确保培养基均匀覆盖培养容器底部。对于培养板，可在加入培养基后，将培养板在实验台上轻轻前后左右移动，使培养基分布更均匀。同时，避免在培养过程中频繁移动培养容器，防止已均匀分布的细胞和培养基重新分布不均。