为何选用溶组织梭状细胞芽孢杆菌胶原酶作为原材料？

胶原酶是肽链内切酶，它能在生理温度和 PH 条件下特异性地水解天然胶原蛋白的三维螺旋结构。胶原蛋白是动物细胞外结缔组织的主要纤维成分。胶原酶是一种蛋白酶，能够特异性地结合在 Pro-X-Gly-Pro 序列的中性氨基酸 (x) 和甘氨酸之间。该序列高频率地存在于胶原中。胶原酶是唯一可以降解广泛存在于结缔组织中具有三股螺旋的天然胶原纤维的蛋白酶。1982 年 Peterkofsky 和 1987 年 Birkedal-Hansen 发现细菌的胶原蛋白酶与脊椎动物的胶原酶不同，它们有更广泛的底物单一性。1975 年 Woolley 和 1974 年 Gross 等多位研究人员发现细菌胶原蛋白酶不像动物的胶原酶仅分解胶原蛋白天然的三维螺旋结构，细菌胶原蛋白酶独特性体现在既能降解非水溶性的天然胶原蛋白又能降解水溶性的变性蛋白。1992 年 Mookhtiar 和 Van Wart 发现细菌胶原蛋白酶能降解几乎所有的胶原蛋白类型，并在三维螺旋区域内有多种分裂形成。

历史：

目前已知的梭菌属的胶原酶源于 19 世纪 50 年代 Mandl, Seifter, Harper 及他们同事的开创性研究， Van Wart 和 Bond 进行后来的分类工作 (Mandl et al. 1953, Mandl et al. 1958, Seifter et al.1959, Harper et al. 1965, Bond and Van Wart 1984)。

1959 年 Worthington 公司第一次从溶组织梭状细胞芽孢杆菌中分离出商业用途的胶原酶。当时只能提供粗提的酶。

自 1953 年 Mandl 第一次从溶组织梭状细胞芽孢杆菌中分离出胶原酶后，19 世纪 50 年代后期到 19 世纪 80 年代中期，1959 年 Granta 和 Alburn，1964 年 Mandl，1965 年 Yoshida 和 Noda，1968 年 Kono，1970 年 Seifter 和 Harper，1970 年 Harper 和 Kang，1976 年 Lwebuga-Mukusa , 1984 年 Bond 和 Van Wart 陆续研究发现几种可分离的胶原酶存在，具有特异性和稳定性的特征。1984 年 Bond 和 Van Wart 发现这几种胶原酶的分子量在 68 kDa 到 130 kDa 之间，根据性能把它们分为 I 类或 II 类，它们活性、稳定性和氨基酸组成不同，但是具有许多相似之处。

直到 1962 年，研究胶原酶大多数人都围绕在溶组织梭状细胞芽孢杆菌。1962 年 Gross 和 Lapiere 在牛蛙蝌蚪的组织培养基中获取到了胶原蛋白酶，这是首次在脊椎动物中获取胶原酶。随后，1966 年 Schoellmann 和 Fisher，1973 年 Welton 和 1975 年 Woods，1975 年 Keil 等分别在海洋动物、其他细菌、两栖动物和哺乳动物中发现大量胶原酶。

人和其它哺乳动物来源的胶原酶被进一步研究报道，为了更好了解人疾病的病理和治疗方法胶原酶继续被积极研究。尤其对胶原酶与风湿性关节炎，新陈代谢，伤口清创，腰间盘突出治疗，血管再生，组织修复和肝硬化的关系感兴趣。

特异性：

1992 年，French 等证实 I 类和 II 类胶原酶最初都能作用于三种胶原蛋白类型。1998 年 Barrett 发现切割位点都在重复 Gly-X-Y 胶原蛋白序列的 Yaa-Gly 之间。溶组织梭状细胞芽孢杆菌胶原酶特殊之处是通过多次切断三维螺旋把天然 1,2,3 型胶原蛋白的三维螺旋结构分解成小的混合多肽。通过把这些碎片水解成小的多肽混合物完成消化。相反，脊椎动物胶原蛋白酶最初只能通过单一切断横穿所有 3 个 a 链完成胶原溶解，对 a 链的作用非常有限。1998 年 Barrett 发现只有在三维螺旋变性之后，白明胶酶和其它蛋白酶才能进行蛋白溶解。

分子特征：

在溶组织梭状细胞芽孢杆菌中胶原酶由两种独立和不同的基因产生。1994 年，Yoshihara 已经对这两种基因进行了克隆和测序。Co/G 基因编码Ⅰ型胶原酶，胶原酶Ⅰ是具有 936 个氨基酸的多肽链。 Co/H 基因编码含有 1021 个氨基酸多肽的 II 型胶原酶，基因有 72% 的一致性，蛋白有 43% 的一致性。两种基因都能产生分子量不同的两种或多种亚型。因而天然的胶原酶混合物由六到八种介于 68kDa 到 130KDa 不同分子量组成。2009 年 Eckhard 和 1999 年 Matsushita 研究底物专一性表明，Co/G 比起 co/H 的产物更容易分解像完整的胶原蛋白这样的天然底物。与之相反，Co/H 更容易对短的合成底物起作用。

Worthington 蛋白酶类型：

1. 无动物源胶原酶

CLSAFA 胶原酶 AFA 去除了潜在的动物身上的病原体，类似于胶原酶 1 或胶原酶 2

CLSAFB 含有更高的胶原酶和酪蛋白酶活性。

CLSAFC 有特别低的胰蛋白酶活性类似于胶原酶 4。

2. 胶原酶 1 含有胶原酶，酪蛋白酶，梭菌蛋白酶和胰蛋白酶活性。用于脂肪、肾上腺和肝脏细胞的分离。

3. 胶原酶 2 含有更多的梭菌蛋白酶活性，适用于心脏，骨，肌肉，甲状腺，软骨和肝脏细胞。

4. 胶原酶 3 有低的蛋白水解活性，适用于乳腺和胎儿细胞。

5. 胶原酶 4 有低的胰蛋白解活性，它可用于胰腺小岛组织的分离。

6. CLSPA 色谱纯化胶原酶，特别的纯，减少了酪蛋白酶活性，提高比活度。用于胰腺和腮腺泡的解离，胶原蛋白结构分析。

Worthington 胶原酶真正为客户考虑

批次间差异是纯化酶典型特征，因而实验前预实验非常重要。Worthington 拥有大量的客户群，根据这些客户的反馈他们认识到要想得到最理性的结果，多批次酶同时对同一样本做预实验才能得到最好的结果。作为把胶原蛋白酶推向市场的先行者，worthington 提供大量不同批次，并根据用途推荐批次。Worthington 可以为客户免费提供试用装，三个不同批次各提供 100 mg 的试用装，有 60 天的时间让客户选出最适合自己的批次，这个批次至少 3 g 会记录客户的名字专门为其保存，但是只有满足起订量是 3 g 才能得到这样的贴心服务。

其它品牌：

Sigma 有胶原酶 1, 胶原酶 2, 胶原酶 4, 胶原酶 5，没有无动物源胶原酶

Gibco 有胶原酶 1, 胶原酶 2, 胶原酶 4

Millipore 有胶原酶 1, 胶原酶 2, 胶原酶 3, 胶原酶 4，也有无动物源胶原酶

Roche 有胶原酶 A，胶原酶 B，胶原酶 D。 胶原酶 A，胶原酶 B，胶原酶 D 含不同比例各种蛋白酶活性。胶原酶 A 有酶活性的正常平衡的比例。胶原酶 B 有高的蛋白酶活性和高的梭菌蛋白酶活性。胶原酶 D 有高的蛋白酶活性和低的胰蛋白酶活性。

编辑： weicf    来源：丁香园