重组蛋白分离纯化的基本原则

不管黑猫白猫，抓到老鼠就是好猫，对纯化来讲亦如此，能拿到纯度好的蛋白，符合纯化要求就是硬道理。不同蛋白纯化工艺不同，即使相同的原料也有不同的纯化方案。蛋白质纯化方法的选择主要是利用不同蛋白质之间的相似性与差异，依据蛋白之间的相似性可以去除非蛋白物质，在根据蛋白的差异性将目的蛋白分离出来，所以要取得好的纯化结果所可以采用的策略及原则却是共通的。

1. 针对不同的产物表达形式采用不同的策略：

a) 融合型表达重组蛋白，一般胞内可溶性的，拟首选用亲和层析进行纯化；

b) 分泌型表达的重组蛋白，通常体积大、浓度低，因此应在纯化之前采用沉淀或超滤等方法先进行浓缩处理；

c) 包涵体型表达的重组蛋白，应先离心回收包涵体；

d) 表达在细胞膜和细胞壁之间的间隙中的蛋白质，应用低浓度的溶菌酶，然后再用渗透压休克法释放重组蛋白。

2. 针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型：

a) 离子交换法（IEX）：等电点处于极端区域（PI≤5 或 PI≥8）的重组蛋白应首选 IEX 进行分离，这样很容易除去几乎所有的杂蛋白。

b) 亲和层析（AC）：重组蛋白特异性的配体、底物、抗体、糖链等都是首选亲和层析纯化的重要条件，原则是它们与目的蛋白之间的解离常熟应在合适的范围内（10-8—10-4mol/L）

c) 疏水（HIC）和反相层析：根据蛋白质的疏水性差异进行分离的。

d) 凝胶过滤层析（GF）: 根据蛋白的分子量进行分离。

3. 每一种方法都有分辨率、处理量、速度和回收率之间的平衡：

a) 分辨率：由选择的方法和层析介质生成窄峰的能力来完成。当杂质和目的蛋白性质相似是，在纯化的最后阶段分辨率是选择层析方法的重要考量标准。

b) 处理量：指在纯化过程中目标蛋白的上样体积和浓度等。

c) 速度：在初纯化中是重要因素，此时杂质如蛋白酶必须尽快去除。

d) 回收率：随着纯化的进行渐趋重要，因为纯化产物的价值在增加。

4. 多种分离纯化技术联合运用：

a) 首选能除去含量最多杂质的方法；

b) 尽量选择高效的分离方法；

c) 将最费时、成本最高的分离纯化方法安排在最后阶段。

d) 通过组合各种方法使纯化步骤之间的样品处理减至最少，以避免需要调节样品。第一个步骤的产物的洗脱条件应适宜下一个步骤的起始条件。

e) 如果对目的蛋白的性质了解甚少的情况下，可采用 IEX-HIC-GF 的联合运用作为标准方案。

常用层析方法的分离特点：                                                                    

5. 重组蛋白分离纯化的共同参考阶段：

a) 捕获阶段：目的蛋白的澄清、浓缩和稳定。选择对目的蛋白具有最高选择性或/和处理量的方法。

b) 中度纯化阶段：目标是除去大多数大量杂质，如其它蛋白、核酸、内毒素和病毒等。

c) 精纯阶段：除去残余的痕量杂质和必须去除的杂质。

三阶段纯化策略中每一种方法的适用性：                                                                                                        

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