G418 筛选实验设计必读

G418 是一种氨基糖类抗生素，其结构与新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似，它通过它通过抑制转座子 Tn601，Tn5 的基因，干扰 80S 核糖体功能而阻断蛋白质合成，对原核和真核等细胞都有毒性，包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞，也包括原生动物和蠕虫。是稳定转染最常用的选择试剂。当 neo 基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后，则能启动 neo 基因编码的序列转录为 mRNA，从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达，使细胞获得抗性而能在含有Ｇ418 的选择性培养基中生长。Ｇ418 的这一选择特性，已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。G418 有杀菌作用，本身有很好的杀菌效果，在用 G418 进行筛选的过程中很少会发生污染。

G418 筛选实验设计:

★ 筛选之前

由于每种细胞对 G418 的敏感性不同，一般变动在 100ug/ml~1000ug/ml 范围。而且不同的厂家生产的相同浓度的 G418 的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定你的细胞对这一批 G418 的最佳筛选浓度。尽管如此，特性明确的细胞系 G418 的最佳用量还是稳定的。《分子克隆》给出了几个常用细胞系所需 G418 的最佳用量。

具体如下：将细胞稀释到 1000 个细胞/mL，在 100ug/mL~1 mg/mL 的 G418 浓度范围内进行筛选，选择出在 10~14d 内使细胞全部死亡的最低 G418 浓度来进行下一步的筛选试验。

★ 加药时间

由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染 24 小时之后才开始加 G418 筛选。随着细胞的代谢 G418 的浓度和活性都回下降，所以每 3~5 天都要更换一次含有 G418 的筛选液。这时药物浓度可以降至 200ug/ml。

★ 培养液

加药筛选约 6 天左右，细胞会大量死亡，孔中只剩下的细胞寥寥无几。这时会出现两个问题：1. 死亡的细胞会裂解释放出有害物质，导致那些有 neo 表达的阳性细胞死亡，即非选择性死亡。2. 孔中细胞数目很少，细胞之间的信号会变得很弱，也会导致阳性细胞的状态不佳甚至死亡。这个时候需要一种特殊的培养液：假如你要转染 3T3 细胞，在 3T3 细胞汇合度达到 80% 的时候，换液，培养过夜之后收集培养液，通过滤器消毒，和新鲜的培养液按 1：1 混合备用。再转染后筛选过程中就可以应用这种培养基。

★ 挑选单克隆的优化

为了尽量减少阴性克隆的死亡给阳性克隆造成的不利影响以及增加阳性克隆的得率，可以应用套环法或刮除法结合有限稀释法来筛选阳性克隆。加药后，在高倍镜下，阳性克隆和阴性克隆很容易辨认，在阳性克隆下用记号笔做个标记。然后刮除隐性克隆，消化阳性克隆后继续筛选培养；或则用套环套住阳性克隆，在套环内加胰蛋白酶或 EDTA 消化，把消化液吸到另外一个新的孔中培养。最后再用有限稀释法把阳性克隆在 96 孔板中筛选。

★ 鉴定之后

一般经过 4 周左右的筛选，得到的阳性克隆都比较稳定。但是外源基因如果没有整合到基因组中的话，目的基因还是很容易丢失的。但是外源基因整合到基因组中的概率太小了，而且是随机整合，会导致表达的目的蛋白的量产生很大差异。随着培养时间的延续，那些丢失了外源基因的细胞和很少表达目的基因的细胞会占据优势，强表达目的蛋白的细胞会越来越少。这样再次筛选是必不可少的。只有经过 2 次以上的筛选之后才能找到那种我们想要的强分泌目的蛋白的，遗传稳定的细胞克隆。

编辑： weicf    来源：丁香园