一个简单的浓缩过程提高膜蛋白的免疫印迹检测水平

大家平时在做 WB 实验的时候，有没有遇到过目的蛋白浓度过低，无法检测的情况？特别是膜蛋白，看看下文的实验大咖是如何解决的，希望可以给大家拓宽思路 

我们建立了一种新的方法提高酵母细胞裂解液膜蛋白的免疫印迹检测水平。我们的方法包括一个简单的沉淀法去除可溶性蛋白的浓缩过程，并且使用一种不需要加热就可以溶解蛋白的凝胶电泳样品缓冲液。这个方法的效果被汉逊酵母 (Pho87、Gas1 和 Pmr1) 蛋白和酿酒酵母 (Gas1) 蛋白所证明。非膜蛋白的免疫印迹表明沉淀部分几乎不含有 Sup45、 carboxypeptidase Y 和 Hog1。然而，在一定程度上，微管蛋白、Sup35 、Tpd3 与膜蛋白一起出现在沉淀中。因为微管蛋白和膜蛋白同时出现在沉淀中，所以管蛋白可以作为一种内参蛋白。

免疫印迹要求精确识别复杂样品中特殊蛋白的电泳条带。每个泳道的总上样量是有限的，从而限制了低含量蛋白的检测。因此，像这样对低含量蛋白进行可靠的分析需要对样品进行浓缩。这里，我们设计了一个简单的过程浓缩酵母裂解液膜蛋白，并为 SDS 凝胶电泳准备样品。我们的方法显著性提高了某些膜蛋白的检测水平。

为了检测汉逊酵母的 Pho87 膜蛋白水平，最初我们使用传统方法准备样品进行免疫印迹检测。这个过程包括玻璃珠破碎细胞以及煮沸含有 SDS 凝胶电泳缓冲液的细胞裂解液样品（1）。尽管每个泳道加入的细胞裂解液样品都很高，但是 Pho87 全长蛋白条带却并不是总能检测到。与此同时，我们总可以看到一个信号很强的条带与 Pho87 降解产物相对应（数据未列出）。 

由于 Pho87 是膜蛋白，它可能被分离到细胞裂解液的细胞膜部分。常规的台式微型离心机就可以进行离心浓缩。例如，植物材料 21000× g 离心 2 h 的膜蛋白和酵母裂解液 16000 × g 离心 45 min 的膜蛋白都可以用于免疫印迹分析。我们假设在细胞破碎时增加盐浓度可以保护 Pho87 不被降解并且刺激膜形成沉淀，促进 Pho87 通过离心进行浓缩。为此，我们对不同醋酸铵浓度（0、1、2 和 3 M）的细胞破碎，离心前的不同孵育时间（0.5、1、2 和 15 h），16,000 × g 不同的离心时间 (2、10、20 和 40 min) 进行测试。结果显示，1 M 醋酸铵孵育 2 h 能够显著增加 Pho87 沉淀（数据未列出）。 

众所周知，煮沸样品会导致膜蛋白的集合。根据之前对可溶性蛋白的经验，我们观察到反复煮沸样品通常会降低免疫印迹信号（数据未列出），这表明煮沸样品会影响蛋白的稳定性。与此同时，细胞裂解液样品中的 SDS 会使蛋白更容易被液泡蛋白酶水解（4）。事实上，即使含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液和常规蛋白分离缓冲液的混合液不进行煮沸，我们也检测不到全长 Pho87 的条带（数据未显示）。为了避免煮样，确保包括蛋白酶在内的细胞蛋白快速变性，我们使用含有 SDS 的样品缓冲液和高浓度的尿素作为促溶剂，与之前描述相似（5）。然后，我们建立了下面的样品准备程序。

方法概述 

为了增强酵母裂解液中的 Pho87 低含量膜蛋白的免疫印迹信号，我们修改了细胞裂解液的电泳样品准备的标准过程。我们加入了一个简单的浓缩步骤，这个步骤减少了大部分的可溶性蛋白，并且使用一种不需要加热的电泳样品缓冲液。

具体步骤

1. 细胞（～30 mg）被悬浮于含有 100ul 缓冲液的 2 mL EP 管中，缓冲液含有 1M 醋酸铵，150 mM NaCl、30 mM Tris-HCl pH 7.5、10 mM 苯甲基磺酰氟、5 mM EDTA 和蛋白酶抑制剂 (11836145001; Roche, Basel Switzerland) 。将玻璃珠加入细胞悬浮液直至覆盖半月形底部。4°C 高速涡旋 7 min，破碎细胞结构。然后加入 0.5 mL 样品缓冲液，并再次瞬时涡旋。取 0.5 mL 玻璃珠上的混悬液转入新的 1.5 mL EP 管，冰浴 2 h。

2. 16,000 × g 离心 10 分钟，膜蛋白形成沉淀。1 M NaCl 洗涤沉淀去除残余的铵离子。

3. 室温下，轻轻吹打 200ul 的尿素-SDS 样品缓冲液（50 mM tris-HCl pH 6.8、2% SDS、 8 M 尿素、1% β-硫基乙醇、2 mM EDTA、5% 甘油、0.004% 溴酚蓝）溶解沉淀。上样前 16,000 × g 离心 10 min 去除不溶解杂质。

这种方法与常规细胞裂解液样品准备（细胞使用玻璃珠破裂或碱性处理的需要煮沸的常规 SDS 电泳缓冲液样品）进行比较。使用实验室中现有的抗体进行分析。抗体包括商业化的β-tubulin 抗体 (PA5–16863; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) 和一些来自汉逊酵母 (Pho87、Sup35、Pmr1、 CPY、Gas1、Tpd3 和 tubulin)) 和酿酒酵母（Sup35、Sup45、Gas1、Hsp104、Rnq1 和 tubulin）的蛋白（如下图）。

与传统方法相比，对于膜相关蛋白（Pho87、Pmr1 和 Gas1），我们的方法得到的结果更好，Tpd3 和微管蛋白也是。Tpd3 与微管蛋白结合在一起的沉淀可能引起与纺锤极体的相互反应。同时，很大一部分 Tpd3 位于细胞核 (8)，这些 Tpd3 可以促进形成沉淀。有趣的是，Sup35 被证明与微管蛋白细胞骨架相关 (9)，并且在沉淀部分也发现它的存在 (图 1)。如果样品是使用一种传统方法准备的，大部分的可溶性蛋白质的信号强度 (Hog1,CPY,Sup45、Hsp104 Rnq1) 比较高。可以假设，在步骤 2 中这些蛋白质没有形成沉淀。事实上，在上清部分存在的蛋白 (CPY 和 Sup45)，在沉淀中的含量是很少的。残留的 Pho87、Pmr1、Gas1、 Tpd3 和 tubulin 通过沉淀法进行了浓缩（数据未列出）。与常规的需要煮沸的 SDS 样品缓冲液相比，含尿素的不需要煮沸的样品缓冲液溶解沉淀大大提高了沉淀样品的检测，特别是 Pho87 蛋白（如下图）。

原文作者：Azamat Karginov and Michael Agaphonov
翻译整理：四正柏

编辑： weicf    来源：丁香园