关于免疫共沉淀实验不得不说的那些事

免疫共沉淀（Co-IP），其原理是当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来, 如果用蛋白质 X 的抗体 anti-X（通常称为 IP 抗体）将 X 特异地抓住并沉淀下来，那么与 X 在体内结合的蛋白质 Y 或者 Z 等也能共同被沉淀下来。目前多用 protein A 或 G 预先固化在琼脂糖或者磁珠 beads 上，蛋白 A 或蛋白 G 对抗体的 Fc 段有较高的亲和力，得到珠子—蛋白 A/G—抗体—目的蛋白复合物，最后通过洗脱或离心得到目的蛋白复合物。

免疫共沉淀实验的注意事项

1.  细胞裂解采用温和的裂解条件，不能破坏细胞内存在的所有蛋白质-蛋白质相互作用或抗原的结构，多采用非离子变性剂 (NP40 或 Triton X-100)。每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验确定。不能用高浓度的变性剂 (0.2%SDS)，细胞裂解液中要加各种酶抑制剂，如商品化的 cooktail。

2.  使用对照抗体：
单克隆抗体: 正常小鼠的 IgG 或另一类单抗
兔多克隆抗体: 正常兔 IgG

3.  要确保抗体的特异性，即在不表达抗原的细胞溶解物中添加抗体后不会引起共沉淀。

4. 确定蛋白间的相互作用是发生在细胞中，而不是由于细胞的溶解才发生的，这需要进行蛋白质的定位来确定。

早期的产品 beads 是采用琼脂糖做成的微球，通过离心沉淀到管底，因颗粒小容易被搅动起来，因此在洗涤的步骤移液动作要非常小心，不能吸走了 beads 也不能残留太多的液体，否则靶蛋白有损失或者残留液体可能导致假阳性信号。逐渐新的材质磁性 beads 就诞生了，磁珠采用磁力架沉淀，沉淀清洗方便又快速，所以越来越多的实验室采用 Co-IP 磁珠。

4ABio Beads Protein A，一种具有超强吸附力、高效而有简便的 IgG 提纯方法。

优点：

（1）简化了小规模纯化的样品处理，无需离心。

（2）高纯度和高产量，相比离心法，磁体吸附法更能避免残留裂解液导致的假阳性，最大产量为 6 mg 人 IgG/ml 磁珠悬液。

（3）轻松地平行筛选抗体，具有高度重现性。

（4）应用于多种规模抗体纯化（低至微升，高至毫升规模）。

（5）操作快捷。

题图来源：shutterstock 正版图库

编辑： weicf    来源：丁香园