多色流式实验荧光素的选择

近十年来流式细胞仪已经成为临床医生、免疫学家和细胞生物学家必不可少的工具，这项技术在不断进步。流式细胞仪的多参数细胞分析这一独特的功能让大多数细胞分析成为了可能。Coon首先提出了荧光抗体标记细胞内的目的蛋白技术，在20世纪80年代，细胞亚群仅仅通过检测单一的细胞表面标志物来确定，使用的单抗和荧光素很受限制。基因表达技术的诞生和新的单抗以及荧光素的获得使更复杂的多参数分析成为可能。

1. 常用荧光素的种类及特性

1）. FITC（Fluorescein）又称异硫氰酸荧光素，其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；FITC 的最大发射波长为525nm，在流式细胞仪的FL1通道检测。

2). PE（R-Phycoerythrin）又称藻红蛋白，有R-PE和RD1的别称，其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；PE 的最大发射波长为575nm，在流式细胞仪的FL2通道检测。

3). PE-TR（PE-TexasRed）/ECDPE-TR又名ECD，是由PE和TexasRed（TR）组合而成的Tandem荧光素；其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；PE-TR的最大发射波长为 615nm，在流式细胞仪的FL3通道检测；PE-TR标记的抗体可用于毫瓦级激光器的小流式细胞仪，也适用于配备有全功率激光器的大流式分选仪。

4). PI（PropidiumIodide）又称碘化丙啶，其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；PI的最大发射波长为617nm。在流式细胞仪的FL3通道检测。

5). PE-Cy5（TRI-COLOR，TC）又称TRI-COLOR或TC，是由PE和Cy5组合而成的Tandem荧光素；其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；PE-Cy5 的最大发射波长为670nm，在流式细胞仪上用FL3通道检测；PE-Cy5 标记的抗体可用于毫瓦级激光器的小流式细胞仪，也适用于配备有全功率激光器的大流式分选仪。

6). PerCP（Peridinin-Chlorophyll-ProteinComplex）多甲藻黄素-叶绿素-蛋白质复合物，其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；PerCP的最大发射波长为677nm。在流式细胞仪的FL3通道检测。

7). APC（Allophycocyanin）又称别藻蓝蛋白，其标记的抗体适用于配备氦氖激光器发射波长为633nm的多色流式细胞仪；APC最大发射波长为660nm，在流式细胞仪中只有配有双激光器的FL4才能检测。

8). APC-Cy7是由APC 和Cy7组合而成的Tandem荧光素；其标记的抗体适用于配备氦氖激光器发射波长为633nm的多色流式细胞仪，APC-Cy7主要用于四色以上的流式细胞术。

2. 常见荧光素荧光强度比较

荧光的强度与染色指数(Stain Index)有关，染色指数的计算：Stain Index=D/W，染色指数越高，荧光强度越好；染色指数较低，染色强度相对较差： 

通过染色指数可以看出各个荧光素的强度：PE>APC>FITC>PerCP 

3. 多色流式细胞检测中荧光素选择的原则

a). 根据机器配置选择荧光素

比如 BD calibour 流式仪，配置有两色激光，能够做 4 个通道的荧光素，需根据对应的激光激发波长和检测通道选择合适的荧光抗体

多色标记荧光素搭配原则：每个通道只能选择一种荧光素；各个通道之间的荧光素可以随意搭配。FACSCalibur 常用的四色搭配：FITC, PE, PerCP, APC

b). 根据抗原表达强弱合理分配荧光素

明确检测指标的表达情况，可将其分为三个层次：

第一层次抗原：这一类抗原通常表达稳定且大多呈高表达状态。如果该类抗原为高表达的话，可以将其与荧光强度较低的荧光素抗体相结合，如 Alexa Fluor 700，Brilliant Violet570^TM，Brilliant Violet 785 TM 或 APC-Cy7。

第二层次抗原：这类抗原对于进一步表型鉴定至关重要，但是在平行实验中表达量也会有所变化。该类抗原表达水平多变，通常适合与中度荧光强度的荧光素抗体结合，如 Brilliant Violet 510^TM，Brilliant Violet 650^TM，FITC 或 PerCP-Cy5.5。

第三层次抗原：这类抗原有可能在不同样本中表达差异很大甚至表达量未知。通常针对这类抗原市面上只有纯化抗体，且其搭配的荧光素类型也较少。对于这类抗原的检测要尽量选择荧光素强度最强的荧光素抗体，如 Brilliant Violet 421^TM，PE，APC 或 PE-Cy7。

c). 选择光谱重叠小的荧光素

由于荧光素的宽发射谱的特点，荧光通道间有光谱重叠现象，因此选择试剂组合时要将光谱叠加可能性减到最低。多色流式实验的时候需要通过补偿调节消除光谱重叠的影响。比如 FITC和 PE，FITC 的发射谱是 530/30，PE的发射谱是 585/42，部分发生重叠。如在进行四色分析，经常会将 PE-Cy5标记的抗体与 APC 标记的抗体搭配使用，此搭配需较大幅度地调节两者的颜色补偿。可选用 PE-Cy5.5 来替代 PE-Cy5，颜色补偿只需 1% 左右。因为 Cy5的激发波长与 APC 的激发波长相近，所以 PE-Cy5 荧光素中的 Cy5，也会被激发 APC 的第二个激光器（氦氖激光器）所激发，导致 PE-Cy5 与 APC 的颜色补偿很难调。相反，PE-Cy5.5 中的 Cy5.5 激发波长为675nm，不能被激发 APC 的第二个激光器所激发，也就不存在 Cy5.5 对 APC的干扰，颜色补偿也就很小。因此，可能需要牺牲个别的荧光的亮度来避免荧光渗漏以及敏感度丧失。 

要通过单标对照进行补偿调节：  

所以尽量选择光谱重叠小的荧光素，如 FITC/PE-Cy7;

选择不同激光激发的荧光素，如 FITC/APC, PE/APC。

d). 尽量避免偶联染料使用带来的假阳性

偶联荧光染料是指两种荧光素联接在一起进行荧光共振能量转移。供方荧光素如 PE，APC 或 Brilliant Violet 421TM 被激光激发，然后通过共振将能量转移给受体荧光素，如 PE-Cy7 中的 Cy7。若使用偶联的荧光素，务必要在短时间内尽快完成实验，曝光时间越长，荧光素就越不稳定。 

编辑： weicf    来源：丁香园