流式检测中性粒细胞吞噬功能

中性粒细胞来源于骨髓，形成特征是具有分叶形或杆状的核，胞浆内含有大量既不嗜碱也不嗜酸的中性细颗粒（polymorphonuclear leukocyte，PMN）。这些颗粒多是溶酶体，内含髓过氧化酶、溶菌酶、碱性磷酸酶和酸性水解酶等丰富的酶类，与细胞的吞噬和消化功能有关。主要功能包括粘附、移动、吞噬杀菌等，是机体天然免疫力的重要组成部分。

吞噬作用（phagocytosis），是中性粒细胞捕获大型颗粒抗原的主要方式，例如对同种细胞、细菌等微生物，都可以吞噬，颗粒被吞入后，由细胞膜将其包绕形成一个吞噬体，吞噬体与溶酶体融合形成吞噬溶酶体（phagolysosome），这时溶酶体酶就会活化，通过一系列的代谢机制将吞入的微生物杀死并进行降解。下面介绍一个简单、灵敏且可靠的流式检测方法。通过结合台盼蓝、白念株菌评估中性粒细胞吞噬功能。利用非穿膜染料诸如台盼蓝或者 EB 淬灭掉未被吞噬细菌表面标记的绿色荧光，转而变成红色，从而与被吞噬进细胞内保持绿色的荧光区别。

Step 1：需分离 PMN 细胞，分离后，中性粒细胞纯度可达 95～97% ，为防止细胞聚集，可加入中浓度为 1 mM 的 CaCl₂ 和 MgCl2。

Step 2：白念珠菌细胞在沙氏液体培养基中培养 18～20 h（30°C），离心洗涤 2 次。用生理盐水溶解，沸水浴中 10 min。计数并重悬，使其浓度为 300 ×10⁶/ml。

Step 3：白念珠菌细胞需要重悬在 NaHCO₃ 缓冲液中，离心洗涤，加入到含有 1.5 μg/ml 5(6)-FAM-SE 荧光的培养基中。 4°C 避光持续搅拌孵育 30 min。加入等体积的 50 mM 甘氨酸缓冲液终止。

Step 4：按照 PMN：5(6)-FAM-SE-labeled C. Albicans=1：3 比例混合，在混合之前，需要对 C. Albicans 先进行超生以避免聚合。4°C 避光孵育 30 min。终止反应后，将混合物加入到流式管中，加入等体积的 TB 溶液（Con.=250 μg/ml，pH4.0）置于冰上 1 min。这样, 样品 pH 值降低到接近 4.0。用 TB 作为淬灭剂，以期把粘附在中性粒细胞表面的荧光素标记的白念珠菌的荧光淬灭。

Step 5：上机检测。

FIG. 1. Trypan blue (TB)-treated polymorphonuclear leukocytes (PMN) phagocytosing 5(6)-FAM-SE-labeled Candida albicans analyzed by fluorescence flow cytometry (FCM)

A: Dot plot of the distribution of green (FL-1) and red fluorescence (FL-3). Four distinct cell subsets are identified, which coincide with as many types of PMN-yeast interactions: quadrant a, no interaction; quadrant b, adherence; quadrant c, adherence and ingestion; quadrant d, ingestion.

a 象限是指中性粒细胞和标记后的白念珠菌未相互作用，随着作用时间的延长，b 象限中性粒细胞周围聚集了很多白念珠菌，台盼蓝将其绿色荧光淬灭，使其发出红色的荧光，随着时间的加剧，c 象限中中性粒细胞吞噬了部分白念珠菌，使其同时可发出红色和绿色的荧光，d 象限中则是代表了中性粒细胞完全吞噬了白念珠菌，使其仅能发出绿色的荧光。

FIG. 2. Trypan blue (TB)-treated polymorphonuclear leukocytes (PMN) phagocytosing 5(6)-FAM-SE-labeled Candida albicans analyzed by fluorescence microscopy.

B: Photomicrograph of phagocytosing PMN showing a mixture of green (ingested) and red (noningested) fluorescing yeasts. The inset shows a cell with several green ingested yeasts and two red membrane bound particles.

一步法可以同时评估中性粒细胞吞噬膜结合和摄入白念珠菌颗粒的作用。此方法是基于 TB 染料能够产生红色荧光的颗粒，同时淬灭 FITC-labeled 颗粒的荧光。同时我们发现,TB 染料在白念珠菌颗粒有相同的性质，不仅能够淬灭 5(6)-FAM-SE-labeled 白念珠菌的绿色荧光, 也可以发出荧光红色。由于 TB 染料不能穿透活细胞, 还能够区别出已经吞噬或者简单粘附在巨噬细胞上。这种预测通过流式细胞术和荧光显微镜已经被证实，已经被吞噬进去的中性粒细胞被检测到绿色荧光，那些粘附在细胞表面的则被检测到红色荧光。

参考文献：

A Single-Step, Sensitive Flow Cytofluorometric Assay for the Simultaneous Assessment of Membrane-Bound and Ingested Candida albicans in Phagocytosing Neutrophils

Sara Busetto, Elisa Trevisan, Pierluigi Patriarca, and Renzo Menegazzi；

编辑： weicf    来源：丁香园