细胞凋亡检测方法及相关产品

细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象，在多细胞生物去除不需要的或异常的细胞中起着必要的作用。它在生物体的进化、内环境的稳定以及多个系统的发育中起着重要的作用。细胞凋亡不仅是一种特殊的细胞死亡类型，而且具有重要的生物学意义及复杂的分子生物学机制。凋亡是多基因严格控制的过程。

根据死亡细胞在形态学、生物化学和分子生物学上的差别，可以将二者区别开来。

目前检测细胞凋亡的方法有许多种，以下是几种常用的方法：

1. 磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V /PI 法）

磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine, PS）正常位于细胞膜的内侧，但在细胞凋亡的早期，PS 可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。

★ 检测原理

Annexin-V 是一种分子量为 35~36KD 的 Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与 PS 高亲和力特异性结合。将 Annexin-V 进行荧光素（FITC、PE）或 biotin 标记，以标记了的 Annexin-V 作为荧光探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。

碘化丙啶 (propidine iodide, PI) 是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI 能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将 Annexin-V 与 PI 匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。

★ 相关产品

★ 如何选择以上试剂盒？  

Annexin V FITC/PI 性价比最高，也是销量最好的凋亡试剂盒。

Annexin V Alexa Fluor488/PI 与 Annexin V FITC/PI 在流式细胞仪上检测用相同的通道，但是 Alexa Fluor488 这种染料荧光强度和稳定性优于 FITC，细胞分群更明显。

Annexin V-eGFP 比 Annexin V FITC 更稳定，效期更长，可以-20℃ 保存。

Annexin V Alexa Fluor647/PI 用于已转染 GFP 细胞的凋亡检测优势明显，而且无需调补偿，避免了人为因素的干扰。

2. Tunel 检测细胞凋亡（DNA 片断原位标记法）

细胞在发生凋亡时，会激活一些 DNA 内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组 DNA。Tunel 是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核 DNA 的断裂情况。

★ 原理

荧光素标记的 dUTP 在末端脱氧核苷转移酶 (TdT) 的作用下，连接到凋亡细胞中断裂的 DNA 的 3-OH 末端，利用由荧光显微镜或者流式细胞检测仪检测凋亡的发生。

★ 应用价值

细胞发生凋亡时，膜上的 PS 外露早于 DNA 断裂发生，因此 Annexin V 联合 PI 染色法检测早期细胞凋亡较 TUNEL 法更为灵敏。又 Annexin V 联合 PI 染色不需固定细胞，可避免 PI 染色因固定造成的细胞碎片过多及 TUNEL 法因固定出现的 DNA 片段丢失。因此，Annexin V 联合 PI 法更加省时，结果更为可靠，是目前最为理想的检测细胞凋亡的方法。

3. Caspase-3 检测

Caspase 家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中 caspase-3 为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3 正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的 Caspase-3 由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3 的活性明显下降。

4. 细胞膜电位变化检测细胞凋亡

JC-1 是一种亲脂性荧光阳离子染料，可掺入线粒体膜，由于线粒体生理性膜电位的存在，形成聚集体。聚集后，JC-1 的荧光性质就发生了改变，从绿光转换为橙光。完整的活细胞 JC-1 染色后，可显示线粒体显著的橙光，可被流式细胞仪 FL2 通道检测到，而凋亡细胞由于线粒体膜电位的降低，从而使得橙色荧光降低，而绿色荧光略增高。通过这种荧光变化，就可以使凋亡细胞和非凋亡细胞区分开来。

如果是标记贴壁细胞，需先将 JC-1 储存液用培养基稀释至 5 µg/ml 的工作液（稀释时注意边稀释边振荡，以防止沉淀形成），然后再将加了 JC-1 的培养基加到贴壁细胞中，37℃ 孵育 10 分钟或室温 15 分钟，最后用 PBS 洗涤两次、胰蛋白酶消化，500 µl PBS 重悬，上机分析。

如果是悬浮细胞，可将悬浮细胞与用培养基稀释至 10 µg/ml 的 JC-1 溶液以 1：1 混合，最终浓度 5 µg/ml，同样 37℃ 孵育 10 分钟或室温 15 分钟，最后用 PBS 洗涤两次，500 µl PBS 重悬，上机分析。

5. 钙离子检测（检测活细胞）与凋亡检测试剂更好判断凋亡

钙离子浓度变化是活细胞接受外界刺激后产生级联反应的重要信息传递方式，因此细胞内钙离子检测是信号转导 G 蛋白偶联受体（GPCR）介导的相关药物筛选以及其他相关实验中非常重要的一种研究手段，该领域中常使用钙离子荧光探针与钙离子的特异性结合来观察细胞内钙离子浓度水平的变化，此类探针未结合 Ca2+前几乎无荧光，结合 Ca2+后，荧光强度显著增强，所显示光谱可被荧光显微镜、流式细胞术、荧光光谱法以及荧光酶标仪等多种方法检测。

编辑： weicf    来源：丁香园