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酵母感受态细胞制备实验

标签: 酵母 感受态细胞 制备

酵母感受态细胞制备可以:(1)用于建立酵母转化体系;(2)用于酵母表达系统构建;(3)用于酵母其他分子生物学研究。

实验方法
  • 化学法
  • 试剂盒制备法
实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤
一、试剂与耗材

1.  试剂
 
细菌用-酵母提取物(Fisher)、 细菌用-蛋白胨(Fisher)、葡萄糖(Fisher)、细菌用-琼脂粉、去离子水、甘油(Sigma)、二甲基亚砜(Sigma)、聚乙二醇3350(Sigma)、醋酸锂(Sigma)、鲑鱼精子细胞DNA(Invitrogen)、酵母无氨基酸氮源(Sigma)、 2-(N-吗啉代) 乙磺酸、腺嘌呤(Sigma)、葡萄糖。
 
2.  仪器
 
水浴锅(VWR)、离心机(Eppendorf)、30 °C摇床与恒温培养箱(VWR)、培养皿。

二、 试剂配方
 
1.  YPDA液体或固体培养基
 
(1)1%酵母提取物: 10 g/L
 
(2)2%胰蛋白胨: 20 g/L
 
(3)2%葡萄糖:20 g/L
 
2.  转化液
 
(1)聚乙二醇3350(50 % (w/v):260 μl
 
(2)1 M醋酸锂:36 μl
 
(3)SsDNA(10 mg/ml):10 μl
 
(4)质粒:3 μl
 
(5)总计:360 μl
 
3.  YNB+ MA 培养基(100 ml)
 
(1)YNB:0.67 g
 
(2)2-(N-吗啉代) 乙磺酸(20mM ):0.39 g
 
(3)腺嘌呤:0.01 g
 
(4)琼脂粉:2g
 
(5)葡萄糖:2g
三、制备步骤
 
1.  在转化实验的两天前,于YPDA培养基的平皿上活化酵母菌株。
 
2.   转化前一天,挑取活化的酵母细胞(单克隆)于YPDA液体培养基中,30°C,200 rpm培养过夜。
 
3.  将培养过夜的酵母细胞液按1:3的比例转接与新的YPDA液体培养基中,于30°C摇床内,200 rpm培养4 h。
 
4.  3 000 g 离心 5分钟收集酵母细胞,用0.5倍体积的无菌水洗酵母细胞。
 
5.  再次3 000 g 离心 5分钟。
 
6.  用0.01倍体积的无菌水重悬酵母细胞,并转入适宜的离心管中,20°C ,3 000 g 离心 5分钟。
 
7.  用0.01倍体积的无菌细胞悬浮液(5 % v/v 甘油,10% v/v 二甲基亚砜)重悬酵母细胞。
 
8.  将重悬的酵母细胞按50 ul分装到1.5 ml离心管中。
 
9.  将管放入塑料盒或者纸盒中(逐步梯度冷冻能够增强酵母的存活率)。
 
10.  将装有酵母细胞的盒子放入-80°C冰箱。(细胞在-80°C能够保存一年以上)。
 
 
 
 
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其他
一、参考文献
 
1.  Gietz R.D., Schiestl R.H. (2007). Frozen competent yeast cells that can be transformed with high efficiency using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method. Nat Protoc 2(1): 1-4.
 
2.   Lu Y., Chanroj S., Zulkifli L., Johnson M.A., Uozumi N., Cheung A., Sze H. (2011). Pollen tubes lacking a pair of K+ transporters fail to target ovules in Arabidopsis. Plant Cell 23(1): 81-93.
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实验方法原理 本酵母化学感受态细胞制备试剂是一种通过化学处理,高效快速制备酿酒酵母化学感受态细胞,用于长期冻存以备后续转化的产品。
实验材料
试剂、试剂盒
仪器、耗材
实验步骤
一、挑取酵母受体菌的新鲜的单菌落(4℃放置不超过3周的也可以),接种到装在50 mL 离心管中的10 mL的自备的YPD培养基中。
 
二、30℃摇晃培养,摇床速度250 rpm/分钟,直到OD600达到0.6-1.0(相当于0.6-1×107细胞/mL)。
 
三、室温3 000 rpm离心5 min,弃上清得酵母细胞沉淀。
 
四、新鲜制备适量的酵母感受态制备工作液。对10 mL酵母需要5.25 mL的工作液,其配制方法是:将4.75 mL制备液A、0.25 mL制备液B和0.25 mL制备液C加入到一个无菌的离心管中后充分震荡混匀即可。酵母感受态制备工作液可放室温待用。
 
五、用0.5倍体积的新鲜配制的酵母感受态制备工作液洗涤酵母细胞沉淀一次(对10 mL酵母则需要5 mL酵母感受态制备工作液)。即混合后振荡1分钟,室温3 000 rpm离心3分钟,去上清得洗涤后的酵母细胞沉淀。
 
六、再用0.02倍体积的酵母感受态制备工作液充分重悬菌体(对10 mL酵母,则需要0.2 mL酵母感受态制备工作液)。
 
七、按每管0.2 mL分装到冷冻管中,放入保温冰盒中冷却半小时后再放入-80℃冰箱待用。0.2 mL的感受态细胞足够1次转化使用。
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注意事项
1.  放入保温冰盒的目的是使温度缓慢下降,急冻将使转化效率降低,这点跟大肠杆菌感受态制备过程不同。
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最新实验心得
(共4个心得)
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更多 谁做这个实验?
  • 怪咖2009

    怪咖2009

    3个月前 觉得一般

    酵母扩大培养时若生长过慢或达到要求所需时间长,说明菌种活性较低,会影响转化效率

  • 考研小生

    考研小生

    3个月前 觉得很简单

    llll

  • viviank

    viviank

    3个月前 觉得难

    有一点难,主要是制作过程需要动作轻柔

  • 赵栋2012

    赵栋2012

    3个月前 觉得简单

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