关键词: 感受态细胞制备 原理 方法
来源: 互联网
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原理:
目前,感受态细胞的制备常用冰预冷的CaCl2处理细菌的方法制备,即用低渗CaCl2溶液在低温(0℃)时处理快速生长的细菌,从而获得感受态细菌。此时细菌膨胀成球形,外源DNA分子在此条件下易形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附在细菌表面,通过热激作用促进细胞对DNA的吸收。转化效率可达106-107转化子/微克DNA。
本方法的关键是选用的细菌必须处于对数生长期,实验操作必须在低温下进行。
操作:
1、取-70℃冰冻菌种,用划线法接种细菌于培养皿,做好标记,于37℃培养过夜。
2、第二天,从平板上挑取单个菌落,接种至含有3ml LB培养液的试管中,37℃振荡培养过夜。次日取菌液1ml接种至含有100ml LB培养基的500ml烧瓶中,37℃剧烈震荡培养约2~3小时(200~300r/min)
3、当菌落600nm OD值达到0.3-0.4时,将烧瓶取出放置冰上10~15分钟。在无菌条件下把菌液倒入50ml离心管中。4℃,4000g离心10分钟。
4、弃上清,将管倒置于干滤纸上1min,吸干残留的培养液。加10ml 0.1M的CaCl2到离心管中,振荡混匀,悬浮菌体,冰浴30分钟。
5、4℃,4000g离心10分钟,弃上清,将管倒置于干滤纸上1min,吸干残留的培养液。加4ml冰预冷的0.1M的CaCl2,重悬浮菌体。每管0.2ml分装,至4℃保存备用,24-48小时内使用效果较好。如果暂时不用,可再保存于-70℃的低温冰箱中。
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第一次离心后出现黑色物体,后面连续做了两次,都有,不知道是哪个环节出现了问题,严格的无菌操作
5 评论
PTWIN1做表达载体表达蛋白的问题
我的表达载体是pTwin1,目的片段和载体均用BamHI 和NruI双酶切,连接,转化入T克隆菌,菌液验证,测序,测序正确;从该菌中提取重组质粒,转化表达菌BL21,菌液验证,然后1:100接种摇菌至OD600为0.6左右,加入IPTG 0.5mM,37度诱导,分别1小时,2小时,3小时,4小时,过夜取样,跑SDS-PAGE,看是否有目的条带。 pTwin1带有两个标签,但我用酶已经切掉了一个,所以他自身只带有一个大约24KD的标签,加上我的目的片段一3KD,大小应该为27KD左右;目的片段二25KD,大小应该为49KD。 我想问 :我的目的蛋白测序正确但好像没表达,怎么回事呢?我已经做了2个月了,很急,请大家帮忙看看,谢谢了。 目的片段一:1为PTWIN1未诱导,2为PTWIN1诱导,3为目的片段未诱导,4-8分别是1h目的片段取诱导样,2h目的片段取诱导样,3h目的片段取诱导样,4h目的片段取诱导样,目的片段过夜诱导取样。MARKER是(最上面那根不算,由上到下116,66.2,45,35,25,18.4,14.14)该目的蛋白应在27KD处表达,但仔细看好像没有表达。
3 评论
构建的原核表达载体不表达我的目的蛋白
换了不同浓度的IPTG,用不同温度,不同诱导时间都做了,但都没有我的蛋白,菌落PCR,双酶切,测序都是对的,为什么不表达呢?
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