质粒转化流程

质粒转化流程，只有操作+原理一起搞懂，实验才不容易翻车。

从-80℃取出DH5α感受态，必须冰上缓慢融化，不能手拿，避免温度骤升降低活性。加质粒一般2 μL就够，过少转化不出来，过多后期单菌落不好分离。加样时手别碰管底，轻轻混匀，动作要柔，感受态很脆弱。

冰上孵育约15分钟，让质粒充分接触感受态。然后42℃水浴热激60-90秒，时间不能太长也不能太短，太长菌活性下降，太短质粒进不去。热激时不要晃动，让温度自然作用。热激后立刻冰浴2分钟。

加培养基：100 μL感受态加500-900 μL培养基，约5-8倍体积，动作轻柔。37℃摇床复苏45-60分钟，转速220，敏感菌可降到150-180。复苏时间要够，让抗性基因充分表达；但也不能太久，否则涂板后菌太密不好挑单菌落。

涂板前可离心收集菌体，4000 rpm 5分钟，去上清，留约100 μL涂板。用玻璃珠涂匀，液体量50-200 μL，一般100 μL。37℃培养箱过夜，第二天看单菌落。

关键原理：温度骤变改变细胞膜通透性，热激让质粒进入细胞；复苏让抗性基因表达，菌才能在抗性板上长起来。