PCR扩增步骤讲解

PCR扩增就三件事：体系配好、程序设对、跑胶看结果。

第一步，配反应体系。冰上操作，依次加无菌水、缓冲液、dNTP、Mg²⁺、上下游引物、模板，最后加DNA聚合酶。模板别加太多，质粒一般1-10 ng，基因组100-500 ng就够。加完轻弹混匀，瞬时离心。

第二步，设置PCR程序。预变性95℃ 3-5 min；循环：95℃变性30 s，退火55-65℃ 30 s，一般比引物Tm低5℃左右；72℃延伸，普通Taq约1 kb/min，高保真酶按说明书；循环25-35次；终延伸72℃ 5-10 min；4℃保存。

第三步，跑胶验证。取5-10 μL产物，加 loading buffer，琼脂糖凝胶电泳，看条带大小是否与预期一致。

常见问题：没条带，先查模板、引物、退火温度；非特异条带，提高退火温度、降低Mg²⁺或减少循环数；引物二聚体，检查引物3'端是否互补；Smear，降低模板量或循环数。新手最容易忽略：模板加太多、引物浓度太高、退火温度随便设、延伸时间不够。