- 讲师介绍
- 视频介绍
讲师介绍
索老师
索莱宝研发
视频介绍
实验简介
免疫组化（IHC）是利用抗体能特异性结合生物组织中抗原这一原理，检测组织切片细胞中特定蛋白质存在与否的方法，在异常细胞诊断以及研究生物组织内生物标志物和差异表达蛋白的分布定位等基础研究中应用广泛。 本试剂盒针对一抗为兔/小鼠来源的石蜡包埋切片IHC实验使用。
溶液配制：
溶液配制：
1. PBS缓冲液：取PBS磷酸盐缓冲液干粉，加入双蒸水，定容至2000mL。
2. 抗原修复工作液：取抗原修复液（50×）20mL，加入双蒸水，定容至1000mL。
3. DAB工作液：取DABkit（20×）显色液1滴约50μL，加入到1mL的DABkit稀释液中，混匀。
操作步骤：
1. 脱蜡：将石蜡切片按顺序置于3-4缸100%二甲苯浸泡，每缸分别5min；
2. 水化：将石蜡切片按顺序转移至100%，100%，95%，85%，75%的乙醇，每缸浸泡3min，最后至蒸馏水或去离子水清洗；
3. 抗原修复：使用柠檬酸修复液（pH6.0）或EDTA修复液（pH9.0）高压热修复2.5min，自然冷却至室温；
4. 洗涤：PBS缓冲液清洗3次，每次3min；
5. 阻断：用吸水纸擦干组织周围玻片，免疫组化笔在组织周围画圈，滴加100μL内源性过氧化物酶阻断剂到切片组织上，室温孵育10min；
6. 洗涤：PBS缓冲液清洗3次，每次3min；
7. 封闭：滴加100μL正常山羊血清封闭液，37℃封闭10-20min；
8. 一抗孵育：用PBS缓冲液或抗体稀释液将一抗原液稀释成工作液，现用现配，在切片上滴加一抗工作液，放入湿盒4℃过夜孵育或37℃孵育1-2h（可参考一抗稀释比例及孵育条件）；
9. 平衡复温：4℃过夜后从冰箱拿出样本，在室温下孵育15min复温（抗体孵育为4℃过夜，选用此步骤，如室温孵育直接进入下一步洗涤）；
10. 洗涤：PBS缓冲液清洗3次，每次3min；
11. 二抗孵育：吸水纸擦干组织周围切片后，滴加100μL羊抗兔/小鼠IgG-HRP，37℃恒温箱30 min 或室温1h；
12. 洗涤：PBS缓冲液清洗3次，每次3min；
13. 显色：每张切片滴加新鲜配制的DAB工作液100μL孵育1-3min；
(1) DAB显色液需现配现用，避光放置，且在30min内使用。
(2) 可根据需要一次染多张切片，各种试剂量按照上述比例放大即可。
(3) 组织的显色时间根据具体显色情况判断深浅度。
14. 复染：滴加适量苏木素染色液复染，孵育3-5min，自来水返蓝15min；
15. 脱水：75%，85%，95%，100%，100%的乙醇浸泡各2min；
16. 透明：二甲苯浸泡2min×2次；
17. 封片：中性树胶封片，镜检；
18. 结果判定：在光学显微镜下对染色的切片观察并判断。苏木素染细胞核为蓝色，DAB显色的阳性表达为棕黄色或棕褐色。
注意：
1. DAB是一潜在致癌物，使用时请注意自我防护。
2.检测样本时需同时做阴性对照和阳性对照。
3.本试剂盒仅用于科研，不能应用于临床。
4.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
