从小鼠脾脏到PBMC：ELISpot样本处理全流程解密

酶联免疫斑点检测（ELISpot）可以在单细胞水平检测分泌蛋白质的细胞频率，灵敏度比ELISA高2-3个数量级。ELISpot是一种功能性检测方法。因此，样本要具有细胞“活性”。

细胞质量是决定ELISpot实验成败的关键因素之一。比如在疫苗研究免疫原性评价中，单核免疫细胞的质量将对实验结果起到决定性作用。从全血中分离单个核细胞，需要特别注意一些可能影响细胞活率和功能的细节。

 

01 可用于ELISpot检测的样本有哪些？

 

理论上，ELISpot可以检测任何分泌蛋白质的细胞类型。现在，ELISpot主要用于检测外周血或脾细胞样本中抗原激活的T细胞分泌的细胞因子及B细胞分泌的抗体。以下样本常用于ELISpot检测：

✔  外周血单个核细胞（PBMC）
✔  肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）
✔  淋巴结细胞（LN）
✔  脾细胞（splc）
✔  从特定组织获得的单细胞悬液
✔  肺泡灌洗液细胞
✔  培养的细胞系（非贴壁、悬浮）
✔  其他悬浮的单细胞

已有研究人员成功用来源于粘膜组织的贴壁细胞进行ELISpot研究。用于ELISpot的细胞样本源自人、小鼠、大鼠、猴子等种属。

 

02影响ELISpot实验结果的因素有哪些？

 

ELISpot技术是对活细胞免疫功能的检测。在加入刺激物后，活细胞分泌细胞因子或抗体，而死细胞和凋亡细胞不会分泌这些物质。除此之外，死细胞还会释放细胞因子、自身抗原、酶等蛋白质，可能会刺激正常淋巴细胞分泌细胞因子，造成阴性对照孔出现非特异性斑点。与此同时，死细胞释放的基因组DNA粘附性很大，会将死细胞及其裂解物甚至活细胞黏附在孔底膜上，使结果出现各种不规则的杂斑和色块，即所谓的“脏”背景。
细胞样品的以下“性能”会影响ELISpot结果：

1. 细胞活性
2. 细胞凋亡程度
3. 非目的细胞数量
4. 细胞的功能状态
5. 可利用的共刺激信号
6. 细胞密度
7. 抗原呈递的有效性
8. 细胞和组织碎片的污染

因此，良好的细胞质量是ELISpot检测结果是否可靠的前提。在实验操作中多个环节都会影响细胞样本质量，如PBMC分离前血液样本的保存、脾细胞的提取、细胞冻存与复苏等。所以每位实验人员都要重视这些环节确保高存活率的细胞样本，容不得半点马虎和凑合，实验室应该建立标准化实验流程，确保细胞活率和实验的可重复性。

细胞活率是ELISpot实验对样本要求的硬性指标，通常在90%以上。对于一些样本受限，难以达到高活率的细胞，可降至80%。但小编建议将细胞活率≥90%设为SOP阈值。以下是人外周血单核细胞（PBMC）、动物脾细胞活率统计，供参考。

 

样本类型	提取细胞活率	复苏后细胞活率
人外周血	>95%	>90%
小鼠脾脏	>90%	>85%

 

03 如何制备小鼠脾细胞？

T细胞、B细胞、NK细胞等淋巴细胞是由淋巴器官（淋巴结、脾脏及胸腺）产生的白细胞。由于小鼠血液量少，难以从外周血中分离大量的淋巴细胞，因此常从小鼠脾脏中获取淋巴细胞。脾脏是机体重要的免疫器官之一，含有的淋巴细胞占全身淋巴组织总量的25%。脾脏具有广泛发免疫功能，是淋巴细胞迁移和受到抗原刺激后发生免疫反应、产生免疫免疫分子的重要场所。

小鼠脾细胞是ELISpot检测的常用细胞样本类型之一。建议脾脏在收集8小时内完成脾细胞分离。脾细胞可直接从脾脏中分离，操作简单。分离后的脾细胞可以立即使用，或冷冻保存。接下来我们就说一说小鼠脾细胞制备的关键操作步骤吧：

1，将小鼠脾脏放在无菌的200目过滤网上或70μm尼龙细胞滤器中，并放置在新的培养皿中，加入少量含10% FBS的RPMI-1640培养基。2，使用注射器活塞平端对组织进行研磨，将小鼠脾脏研磨至无固体状态。需要轻轻研磨，并且避免过滤网与培养皿底直接接触，以免因研磨造成大批细胞死亡。
3，用5mL培养基对滤网上的细胞进行冲洗，并全部转移至新的15mL无菌离心管中。
4，1400 r，离心5min，弃上清。
5，加入5mL红细胞裂解液，裂解5 min后再加入5mL培养基终止。
6，300 g，离心5min，弃上清。
7，加入5mL培养基重悬，使用400目过滤网过滤。
8，1400 r，离心5min，弃上清。
9，加入2mL培养基，轻柔吹打，重悬细胞。
10，取样计数，并根据实验需求将细胞稀释至合适的工作浓度。

 

04 PBMC分离注意事项有哪些？

ELISpot是不能评估全血的T细胞或B细胞的免疫应答反应的，需要先分离获得PBMC后再进行测试。外周血单个核细胞（PBMC）是一类免疫细胞，其特征是有一个圆形的细胞核，由淋巴细胞（T、B、NK）、单核细胞组成。

一、蔗糖聚合物（Ficoll）密度梯度离心法制备PBMC

1，实验前准备：Ficoll密度梯度介质提前恢复至室温（18-20℃）。
2，1:1稀释全血：将抗凝全血从采血管转移至新的无菌50 mL离心管中，加入等体积的PBS。轻轻颠倒管子，使血液和PBS混匀。
3，准备离心：取新的50 mL离心管，先加入15 mL Ficoll，再加入稀释后的15 mL血液。血液要缓慢的加入，可适当倾斜离心管，使移液器枪头紧靠管壁，位于Ficoll液面上5-10mm处，慢慢加入，避免Ficoll分离介质和血液界面搅乱，保持两种液体分界面清晰。
4，密度梯度离心：将离心管放入离心机，室温1000 x g离心30min。请注意：要关闭离心机的快升速和减速设置，防止升速或降速过快破坏液体分层。
5，收集PBMC：用移液器缓慢吸掉上层血浆层（约15mL）。然后从边缘开始，缓慢吸取PBMC层至新的离心管中。剩余的Ficoll和红细胞层可弃掉。
6，洗涤：在PBMC中加入5倍体积的PBS或培养基，室温300x g离心5-10min。小心弃去上清。为确保Ficoll彻底清除可重复洗涤一次。
7，重悬细胞：加入5-10mL培养基，轻柔吹打，重悬细胞。

 

二、PBMC细胞分离注意事项

1，抗凝剂建议使用肝素或柠檬酸钠，不要使用EDTA。EDTA会螯合钙离子影响细胞因子分泌。
2，全血建议放置在室温，且时间不宜超过8小时。低温会影响PBMC的细胞活率，还会导致样本中的粒细胞激活，抑制T细胞的应答反应。
3，如果血液样本存储时间超过20小时，样本中的粒细胞会被激活。建议在对血液样本保存前，用PBS或RPMI-1640培养基按1:1的比例进行稀释。
4，提取PBMC的所有试剂均需提前置于室温平衡，离心机温度设置为20-25℃，切勿处于4℃低温状态。
5，PBMC制备过程中，需要将红细胞去除干净，若分离过程中仍有红细胞可考虑使用裂红的方法去除。
6，B细胞在PBMC中占比较少，约5-12%。如果要做B细胞的ELISpot，建议进行B细胞富集。

 

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