Nat Commun丨慢性内脏疼痛影响摄食行为的关键神经环路机制

通过新生鼠结肠炎症（NCI）诱导慢性内脏疼痛，测量6-12周龄小鼠的结肠直肠膨胀（CRD）阈值，得出NCI小鼠的CRD阈值显著低于对照组（CON）小鼠，表明模型成功建立。其次，通过自由摄食实验发现，食物摄入比例与停留时间在食物区内呈正相关。与对照组小鼠相比，NCI组小鼠体重显著减轻。经腹腔注射常规镇痛剂后，NCI诱导的慢性内脏疼痛得到缓解，与治疗前相比，NCI组小鼠经药物处理后脂质摄入量显著增加。综上，慢性内脏疼痛会导致小鼠食物偏好的改变（图1）。

图1  慢性内脏疼痛导致食物偏好的改变

为探究PVH是否参与NCI诱导的慢性内脏高敏感性，通过比较小鼠PVH中c-Fos的表达水平，发现NCI 小鼠 PVH 中 c-Fos 表达细胞数在多次 CRD 刺激后显著增加，且多数 c-Fos 阳性神经元与 CCK 抗体共标。为阐明PVH^CCK神经元在内脏疼痛感知中的功能作用，通过钙成像法，将AAV2/9-CCK-GCaMP6f-EGFP病毒注射至PVH区域，用于标记NCI组和CON组小鼠的CCK神经元。结果显示，经相同程度CRD刺激的NCI组小鼠Ca²⁺活性显著高于CON组。随后膜片钳技术检测发现，当施加相同电流刺激时，NCI组小鼠CCK神经元的放电频率显著高于CON组。CCK神经元的动作电位半宽和动作电位频率显著高于CON组。接下来作者将AAV2/9-CCK-hM3Dq-mCherry和AAV2/9-CCK-hM4DimCherry注射到CON小鼠和NCI小鼠的腹侧被盖区对PVH^CCK神经元进行基因编辑。通过化学遗传学激活CCK神经元显著降低了CON小鼠的条件反射阈值（CRD），使食物偏好从脂质转向蔗糖；抑制则增加 NCI 小鼠 CRD 阈值，使偏好从蔗糖转向脂质。综上，PVH^CCK神经元参与调节慢性内脏疼痛诱导的小鼠食物偏好变化（图2）。

图2  PVH^CCK编码慢性内脏疼痛引起的食物偏好变化

为明确PVH与VH区神经元在慢性内脏疼痛中的神经环路关系，作者首先通过将顺行示踪病毒AAV2/9-hSyn-EGFP注射至PVH区域，显示 PVH 神经元投射至 ACC。为进一步探究PVH与ACC的连接机制，作者在VGlut2-Cre小鼠中进行了基于单突触传播的狂犬病病毒逆行示踪实验，结果显示ACC的谷氨酸能神经元与PVH存在连接。为验证PVH-ACC通路，作者向ACC注射逆行示踪病毒，不仅在ACC，还在前额叶皮层、屏状核、岛叶皮层及PVH区域均观察到GFP标记信号。进一步探究ACC^Glu神经元是否直接接收来自PVH^CCK的投射信号。通过向PVH区域注射AAV2/9-EF1a-Dio-hM4Di/hM3Dq-mCherry和AAV2/9- CCK-Cre病毒标记CCK神经元，同时向NCI组和CON组小鼠的ACC区域注射AAV2/9-VGlut2-GCaMP6f-EGFP病毒标记Glu神经元。数据显示，在相同CRD条件下，hM4Di+CNO小鼠的Ca²⁺抑制水平显著低于hM4Di+NS小鼠。而hM3Dq+CNO小鼠在相同CRD刺激下的Ca²⁺活性则显著高于hM3Dq+NS小鼠。综上，PVH中的CCK阳性神经元可能在调节ACC^Glu中起调节作用（图3）。

图3  PVH^CCK神经元投射到ACC^Glu神经元

JARVIS

通过神经化学诱导（NCI）小鼠慢性内脏疼痛，结果显示，与对照组（CON）小鼠相比，NCI组小鼠双侧ACC区域的CCKB受体（CCKBRs）在蛋白和mRNA水平均显著升高。然而，CCKA受体（CCKARs）的蛋白和mRNA水平在任一侧ACC区域均未显著上调（图4）。

图4  NCI小鼠中CCKBRs的ACC表达增加

为了研究CCKBRs参与NCI小鼠慢性内脏疼痛的分子机制。结果表明，ACC中PVH^CCK末梢的雷酸盐激活显著增强了ACC^Glu中sEPSCs的频率和振幅；CNO诱导的ACC中PVH^CCK神经末梢激活显著降低了食物限制阈值；雷酸盐抑制ACC中PVH^CCK神经末梢显著提高了食物限制阈值。以上效应可通过相应激活/抑制ACC中CCKBRs进行逆转。综上，ACC中CCKBRs的过度活跃可能参与了NCI小鼠慢性内脏疼痛及其后续食物偏好改变的过程（图5）。

图5  CCKBRs介导PVH^CCK-ACC^Glu环路在慢性内脏疼痛诱导的食物偏好变化中的调节作用

在慢性内脏疼痛小鼠模型中，腹侧腹内侧核丘脑皮层丘脑核（PVH^CCK）神经元参与了饮食偏好的调节。进一步研究发现，PVH^CCK神经元直接激活前扣带回谷氨酸能神经元（ACC^Glu），从而影响NCI小鼠的饮食选择。当抑制ACG小鼠中PVH^CCK神经末梢时，不仅缓解了慢性内脏疼痛，还改变了其进食行为。这些发现为理解慢性内脏疼痛与饮食偏好之间的关联提供了新视角。