【小优细节君】怎么做好mTOR这种大分子量的wb？

mTOR

mTOR全称为哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin），是PI3K相关激酶家族中的一种丝氨酸蛋白激酶。在真核细胞中，mTOR可以通过感知和整合生长因子、能量状态和营养水平等外部信息，调节细胞生长发育和细胞自噬等重要生命过程^[1]。mTOR信号通路的功能障碍可以引起多种疾病，包括肥胖和糖尿病，甚至肿瘤^[2]。mTOR信号通路是一个非常经典的热门靶点，那么今天小优细节君就带大家一起了解一下这个蛋白。

mTOR可以形成两种不同的复合物mTORC1和mTORC2，来行使不同的功能^[3]。mTORC1和mTORC2的差异请见下图：

 

图1 mTORC1和mTORC2的区别

mTORC1主要响应营养、能量和生长因子等信号，通过磷酸化下游效应子来促进蛋白质、脂质、核苷酸和葡萄糖的合成，抑制蛋白质的分解。主要下游效应子有S6K1、4E-BP1、ULK1，还有多种转录因子，从而发挥不同的功能。

mTORC2主要充当胰岛素/PI3K信号通路的效应子，功能虽少，但是非常重要。同时也受mTORC1的负反馈回路调节^[5]。

如果各位小伙伴不知道要研究下游哪个蛋白，可以参考下图。

图2 mTOR信号通路

通过前面的介绍，相信大家对mTOR的结构和功能有一定的了解，接下来小优细节君就和大家一起探讨一下关于WB检测中mTOR和磷酸化mTOR经常遇见无信号的情况，该如何解决。

01 首先需要了解所使用样本的表达量情况。

虽然说mTOR是个生长和代谢重要的蛋白，几乎在所有组织中都有表达，但是组织间也是有明显高低差异的，如果忽略了这点，可能就会出现无条带或者弱条带的情况。我们可以通过查阅数据库如The Human Protein Altas，BioGPS，Depmap等去查看样本表达的高低。如下图，脂肪组织，平滑肌组织，淋巴结组织就未检测到蛋白表达。

 

图3 HPA各组织中mTOR的表达水平

如果样本表达较少可以通过增加上样量，组织样本上样50ug以上，细胞样本上样20ug以上，加上充分裂解样本（超声处理）。同时也可以通过增加阳性对照样本来排查问题。

Tips：样本如何超声，使用超声频率是30%-40%的超声仪，冰浴超声5s*3次;  如果没有超声仪，可以用1ml 带针头注的射器冰上反复抽吸至无阻力。

02 排除WB实验步骤问题，尤其是转膜步骤。

由于mTOR蛋白分子量达到289KDa，大分子量WB从来不是一件容易的事情，我们需要额外注意一些细节：

❖Marker：更换大分子量marker，方便判断条带位置。

❖电泳：是否选择合适的胶，电泳时间是否足够蛋白跑下来。我们建议使用6%的胶，电泳时间延长至1.5-2h。

❖转膜：转膜液甲醇浓度，转膜电流，时间和温度是否合适。我们推荐降低转膜液中的甲醇浓度，5-10%，可以额外添加0.1%SDS帮助蛋白转移。转膜选择恒流转，200-250mA，时间3-4h，转膜期间务必保持低温。

03 如果total mTOR没问题，p-mTOR无条带，我们还需要判断对样本的刺激方式是否合适，是否成功诱导磷酸化。

1) 从PSP数据库中，我们可以查到常用的刺激物是什么。括号里的数字为参考文献，可以点击具体查看。

图4 PSP中Ser2448推荐的刺激方式

如果刺激物没问题，我们还需要进一步做一下浓度和时间的梯度，来确定最佳的实验条件。

2) 我们可以参考厂家官网上查看质检所用的样本是如何刺激处理的。

 

图5 CST官网上mTOR的刺激方式

3) 制样时必须加入磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂，防止磷酸化蛋白降解。也可以检测相关的上下游磷酸化蛋白以佐证实验步骤正常。

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产品货号	产品名称
2972	mTOR Antibody
2983	mTOR (7C10) Rabbit mAb
2971	Phospho-mTOR (Ser2448) Antibody
5536	Phospho-mTOR (Ser2448) (D9C2) XP® Rabbit mAb
2974	Phospho-mTOR (Ser2481) Antibody
abs131824	Rabbit anti-mTOR Polyclonal Antibody
abs145961	Rabbit anti-mTOR Polyclonal Antibody
abs110544	Rabbit anti-mTOR Polyclonal Antibody(S2481)
abs123914	Rabbit anti-mTOR Polyclonal Antibody

 

参考文献：

[1] Mardanshahi, A., N.A. Gharibkandi, S. Vaseghi, et al. The PI3K/AKT/mTOR signaling pathway inhibitors enhance radiosensitivity in cancer cell lines[J]. Molecular Biology Reports, 2021, 48(8): p. 1-14.

[2] Harrington LS, et al. The TSC1-2 tumor suppressor controls insulin-PI3K signaling via regulation of IRS proteins. J Cell Biol. 2004;166(2):213–223.

[3] Wang L, Rhodes CJ, Lawrence JC., Jr Activation of mammalian target of rapamycin (mTOR) by insulin is associated with stimulation of 4EBP1 binding to dimeric mTOR complex 1. J Biol Chem. 2006;281:24293–24303.

[4] Saxton RA, Sabatini DM. mTOR signaling in growth, metabolism, and disease. Cell. 2017;168:960–976.

[5] Popova NV, Jücker M. The role of mTOR signaling as a therapeutic target in cancer[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2021, 22(4).