为什么细胞会变老？对实验有多大影响？如何让它们保持年轻？

细胞老化（Cellular Senescence）是指细胞在经历一定数量分裂或受到各种应激刺激后，永/久退出细胞周期，失去增殖能力，但仍具有代谢活性的一种状态^【1】。

这是一种普遍存在于体内和体外的生物学现象，是机体调控的重要组成部分。虽然名字里带老，但它并不仅仅意味着细胞衰弱，更像是细胞主动踩下了刹车，防止潜在的恶性转化。

从机制上看，细胞老化可分为两类：

复制性衰老（Replicative Senescence）：主要由端粒缩短引起。当细胞分裂次数接近极限（Hayflick极限）时，端粒耗尽，触发细胞周期抑制。

应激诱导性衰老（Stress-Induced Premature Senescence, SIPS）：由DNA损伤、氧化应激、辐射、化学药物等诱导，即使端粒未明显缩短也可发生。

在实验室中，判断细胞是否老化，常需综合形态和分子指标：

1.形态学变化

细胞体积明显增大，变得扁平，形态不规则

细胞核增大，核膜不规则，染色质呈异染色质聚集

胞质内空泡增多

2.分子标志物

SA-β-gal（衰老相关β-半乳糖苷酶）活性增强：在pH 6.0条件下染色呈阳性

细胞周期抑制蛋白上调：如p16^INK4a^、p21^Cip1/Waf1^、p53

SASP（衰老相关分泌表型）：老化细胞会分泌大量炎症因子（如IL-6、IL-8）、蛋白酶、趋化因子等

DNA损伤标志：γ-H2AX焦点聚集

图源：参考文献2

2. 对细胞实验的影响

增殖能力下降：传代速度变慢，甚至无法继续传代

实验数据偏差：老化细胞的基因表达谱、代谢状态与正常细胞有显著不同，导致实验结果失真

形态改变：不利于成像、分选等实验

对药物反应变化：可能影响药敏实验或信号通路分析结果

虽然细胞老化不可完全避免，但可以通过优化操作延缓其发生，尤其在体外培养中：

1. 控制传代次数

不同细胞系或原代细胞有不同的可传代上限

建议在实验前查阅细胞系说明书或CCTCC资料，设定“安全传代范围”

建立“种子库”体系：早期传代冻存多份细胞，避免长时间连续传代

2. 优化培养条件

保持适宜的培养温度（37℃）和CO₂浓度（一般为5%）

及时更换培养基，避免营养匮乏或代谢废物积累

避免过度汇合（Confluency >90%），因为过密会诱导应激信号，促进老化

3. 降低应激暴露

减少紫外线照射、强光显微镜长时间观察

使用低毒性试剂，避免频繁暴露于高浓度氧化剂、放射线

操作轻柔，避免反复强烈吹打细胞

4. 使用抗老化辅助措施（实验室条件）

添加抗氧化剂（如NAC、谷胱甘肽）可降低氧化应激

在诱导多能干细胞、器官类器官培养中，可使用ROCK抑制剂（如Y-27632）短期保护细胞

对特定模型，可应用端粒酶激活策略延长寿命^【5】（需注意伦理与安全性）

5. 定期检测老化状态

每隔一定时间（如每5–10代）检测SA-β-gal活性、p16/p21表达等指标

对结果敏感的实验，建议使用较低代次的细胞重复验证。

细胞老化既是生命自然规律的一部分，也是实验室科研需要严肃面对的技术挑战。理解老化机制、识别老化特征，并采取有效措施延缓老化，不仅能提高实验重复性，也有助于探索衰老相关疾病的机理。

简单记住三句话：

细胞也会变老，且比我们想象得快

老化既有保护作用，也会带来负面影响

早期冻存、减少应激、保持适宜环境是延缓老化的关键