项目文章 | 西北农林科技大学李明军/马百全研究团队发现苹果酸度调控机制

 

果实的酸度是影响果实风味和品质的关键因素之一。在苹果中，主要的有机酸是苹果酸，其含量对果实的口感和加工品质有显著影响。

 

近日，西北农林科技大学苹果抗逆与品质改良创新团队李明军教授/马百全副教授课题组在Plant Physiology上发表的题为“Transcriptional factor MdESE3 controls fruit acidity by activating genes regulating malic acid content in apple ”研究论文，验证了MdMa11在控制果实酸度方面的作用，并通过酵母单杂交筛选，找到了调控其表达的转录因子MdESE3，结合一系列分子及遗传转化实验，解析了MdESE3的关键结合motif及其提高苹果中有机酸积累和酸度的分子机制。

 

本项目中苹果酵母cDNA文库由欧易生物构建。

 

 

酵母文库：苹果酵母cDNA文库

诱饵启动子：MdMa11的启动子（分为3段）

筛选方法：酵母单杂交（Y1HGold-pAbAi系统）

验证方法：Y1H assay/LUC/GUS

 

技术路线

 

 

研究结果

 

1. MdMa11在转基因苹果愈伤、果实及植株中的功能分析

 

研究者前期已经利用烟草叶片的遗传转化系统，发现了MdMa11（编码质子泵蛋白，介导H+的跨膜转运，维持液泡酸度）可以显著调控植物pH。本研究进一步在苹果的不同材料中进行MdMa11的功能验证。结果发现过表达MdMa11的苹果果实、苹果愈伤、苹果植株中苹果酸含量均显著上升，而对应的沉默材料中苹果酸含量均显著下降（图1）。说明MdMa11参与了苹果中苹果酸的积累通路。

 

图1 MdMa11在转基因苹果愈伤组织、果实和植株中的功能分析

 

2. 与MdMa11启动子结合的关键TF的鉴定

 

研究者克隆了MdMa11的5417bp启动子，并将其分成了3段分别进行酵母单杂交筛选，结果共筛选到85个阳性克隆，其中使用含有ERE motif的启动子片段为诱饵筛选到的阳性克隆中有1个含有AP2结构域的蛋白。基于拟南芥基因组注释分析，将其鉴定为转录因子蛋白MdESE3。此外，通过Y1H点对点验证进一步确认了MdESE3可以与含有MdMa11启动子ERE的片段结合。

 

3. MdESE3的系统进化树、表达谱及亚细胞定位分析

 

MdESE3的CDS全长540bp，其上含有1个高度保守的AP2 DNA结合结构域（图3）。遗传进化分析发现它与梨的PbERF003同源性很高。对其表达谱鉴定发现它在各组织中均有表达，其中表达量最高的3个组织分别是茎、根和果实组织。通过构建MdESE3-GFP载体进行亚细胞定位检测发现其只定位在细胞核，是一个核蛋白。

 

图2 MdESE3的鉴定、定位、表达和系统发育分析

 

4. MdESE3在转基因番茄、苹果愈伤、果实及植株中的功能分析

 

接下来，研究者通过过表达及沉默实验，在番茄以及苹果愈伤、果实及植株中对MdESE3进行了功能验证。结果发现过表达或者沉默表达MdESE3的番茄及苹果果实、苹果愈伤、苹果植株，在形态大小上与对照组无显著差异，但是过表达MdESE3番茄中，苹果酸、柠檬酸含量均显著上升，pH显著下降。在过表达MdESE3的苹果材料中，苹果酸含量显著上升，而对应的沉默材料中苹果酸含量均显著下降（图1）。说明MdESE3参与了苹果中苹果酸的积累通路。

 

图3 MdESE3在AC番茄、转基因苹果愈伤组织、果实和植株中的功能分析

 

5. MdESE3结合MdMa11的启动子并激活其转录

 

在构建的转基因MdESE3材料中，研究者发现MdMa11的表达量显著升高，而MdESE3沉默的苹果材料中MdMa11的表达量显著降低。而且在对MdMa11的启动子区域分析发现，只存在1个ERE motif。研究者推测，MdESE3可以直接结合ERE motif并激活MdMa11转录，并通过GUS和LUC实验，对此推测进行了验证，并最终锁定在MdESE3可以直接结合ERE(5ʹ-TTTAAAAT-3ʹ) motif而激活MdMa11的转录。

 

6. MdESE3可以结合MdMDH2和MdtDT的启动子并激活其转录

 

在构建的转基因MdESE3材料中，研究者也检测了其他7个与苹果酸合成转运相关基因的表达量变化，结果发现在过表达的苹果果实和植株中，MdtDT，MdDTC2以及MdMDH12的表达量显著上升，在对应的沉默材料中，其表达量均显著下降，进一步分析了这3个基因的启动子区域。结果发现，只有MdMDH12和MdtDT两个的启动子中含有ERE(5ʹ-TTTAAAAT-3ʹ) motif。通过酵母单杂交（Y1H）、LUC及GUS实验对MdESE3与这两个基因的启动子结合互作进行了验证（图4）。结果证实了MdESE3能够与MdMDH12和MdtDT启动子结合并激活其转录。

 

图4 MdESE3与MdMDH12和MdtDT启动子结合并激活转录

 

研究结论

 

MdESE3对苹果果实中苹果酸调控的工作模型

 

该研究对MdESE3及MdMa11在调控苹果酸度方面进行了功能验证，并揭示了MdESE3通过结合MdMa11、MdtDT和MdMDH12基因启动子，激活其转录从而调控苹果酸积累的分子机制，为改善苹果果实品质提供了潜在的基因资源。

 

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西北农林科技大学园艺学院在读博士研究生郑丽桐，已毕业硕士马文芳为共同第一作者，西北农林科技大学作物抗逆与高效生产全国重点实验室/园艺学院李明军教授与马百全副教授为论文通讯作者。马锋旺教授、博士后祝令成、魏晓钰参与了相关研究工作。园艺科学研究中心张静、袁阳阳和曹文静等老师对本研究提供了技术支持。该研究得到了国家自然科学基金，国家重点研发计划、中国博士后科学基金等项目支持。

 

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